液相色谱-串联质谱法测定育肥猪配合饲料中的阿奇霉素

唐 祥，赵立军，罗 成，吴彩梅*，闫珊珊，刘光芒，林 燕，吴 德

(1.四川农业大学 动物营养研究所，四川省动物抗病营养重点实验室，农业部动物抗病营养与饲料重点实验室，四川 成都 611130；2.农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室(成都)，四川 成都 610041；3.四川大学 化学工程学院，四川 成都 610065)

液相色谱-串联质谱法测定育肥猪配合饲料中的阿奇霉素

唐 祥1，赵立军2,3，罗 成1，吴彩梅1*，闫珊珊1，刘光芒1，林 燕1，吴 德1

(1.四川农业大学 动物营养研究所，四川省动物抗病营养重点实验室，农业部动物抗病营养与饲料重点实验室，四川 成都 611130；2.农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室(成都)，四川 成都 610041；3.四川大学 化学工程学院，四川 成都 610065)

通过对提取溶剂、净化方法及色谱-质谱条件的优化，建立了配合饲料中阿奇霉素(AZM)的液相色谱-串联质谱测定方法。样品经乙腈超声波提取，MCX固相萃取柱净化，BDS Hypersil C18(2.4 μm，100 mm×2.1 mm)色谱柱分离，以甲醇-0.05 mol/L乙酸铵水溶液为流动相梯度洗脱，正离子模式电离，多反应监测模式检测，同位素内标法定量。在优化条件下，AZM在1～250 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)为0.999 1，检出限(S/N≥3)为2.8 μg/kg，定量下限(S/N≥10)为8.4 μg/kg；在0.5，1，5，10 mg/kg加标水平下，回收率为87.0%～106.6%，批内相对标准偏差为0.58%～5.4%，批间相对标准偏差为3.1%～5.4%。该方法准确、灵敏，选择性强，基质干扰小，可用于配合饲料中AZM的测定。

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；阿奇霉素；育肥猪；配合饲料

阿奇霉素(Azithromycin，AZM)是结构类似于红霉素的15元环大环内酯(Macrolide，MAL)抗生素[1]，广泛用于人上下呼吸道、泌尿道、皮肤及软组织感染和性传播疾病的预防和治疗[2-3]。地方兽药标准曾收录AZM用于兽医临床治疗，但人用抗菌药物用于食品动物，会产生耐药性问题，从而影响动物疫病控制、食品安全和人类健康。2005年8月农业部发布第560号公告，AZM不符合兽药安全有效审批原则，取消收录AZM等MALs为兽药的地方标准，将AZM列为禁用兽药[4]。虽然国家明令禁止，但养殖环节带来的经济效益受损，养殖户将抗生素添加于饲料或针剂注射等方式给药，导致人用抗生素仍被滥用于畜禽，已成为威胁畜禽产品安全的新隐患。因此，建立饲料中AZM准确、灵敏的检测方法是加快实现无抗养殖，保证食品安全的重要任务。

目前AZM的检测研究主要集中在AZM制药原料、人和动物的血液等基质，检测技术主要有微生物法[5-6]、电化学法[7-8]、液相色谱法(LC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等。其中，微生物法操作繁琐、费时、精密度差、检出限高，无法满足残留分析要求。美国药典使用安培电化学检测器测定AZM含量，其要求流动相pH值达到11和使用价格昂贵的氧化铝色谱柱[9]。AZM的紫外吸收弱，采用配备紫外检测器的LC法[10-12]进行测定时，会导致峰形不对称和柱效降低。配备荧光检测器的检测方法[13-14]可提高检测灵敏度，但样品需衍生，其处理过程费时，结果易受衍生条件影响。而高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法无需衍生、选择性好、灵敏度高、应用范围广。

由于饲料中AZM的检测方法未见研究报道，国内及国际有关AZM的检测标准亦未见报道，因此本研究通过对提取溶剂、净化方法及色谱-质谱条件的优化首次建立了配合饲料中阿奇霉素的HPLC-MS/MS法。通过对方法的选择性、精密度和准确度、检出限和定量下限、基质效应和提取效率的测试，对方法的可行性进行了分析。并将该方法用于育肥猪配合饲料样品中AZM的测定，相关数据为配合饲料中AZM的风险评估以及检测标准的制定奠定了基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪(Agilent 1200-6430 Triple Quad，美国Agilent公司)；涡旋振荡混合器(德国IKA公司)；低温离心机(日本Hitachi公司)；旋转蒸发仪(美国Organomation公司)；固相萃取装置(美国Agilent公司)；超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

阿奇霉素标准对照品(纯度≥97.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；阿奇霉素同位素内标(Azithromycin-d3，纯度≥98.0%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；Oasis MCX固相萃取柱、Oasis HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱(3 mL，60 mg；美国Waters公司)；甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙酸铵(色谱纯，美国Sigma公司)；乙酸乙酯、乙醚(分析纯，中国川东化工有限公司)；氨水(分析纯，中国西陇化工有限公司)。实验用水为纯水系统(美国Millipore公司)制备的超纯水18.2 MΩ·cm。

1.2 标准溶液配制

精密称取适量的AZM和AZM-d3对照品，用甲醇溶解稀释，分别制成1 mg/mL和0.1 mg/mL的标准储备液，于-20 ℃条件下保存。使用时，用初始流动相逐级稀释至所需浓度。

1.3 HPLC-MS/MS条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：BDS Hypersil C18(2.4 μm，100 mm×2.1 mm)；流动相为甲醇(A)和50 mmol/L乙酸铵水溶液(B)；流速：0.2 mL/min；进样体积：5 μL；柱温：30 ℃；梯度洗脱程序：0～3 min，90% A；3～3.5 min，线性变化至100% A；3.5～5 min，100% A；5～5.5 min，线性变回至90% A；5.5～8.5 min，90% A；分析总时间为12 min。

1.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，多反应监测模式(MRM)检测。离子源温度：300 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；氮气作为去溶剂气体，流速：10 L/min；雾化器压力：40 psi；辅助气压力：15 psi；毛细管电压：4 000 kV；锥孔电压：4 000 kV；碰撞气体为氩气。定性、定量离子对及碰撞能量等参数见表1。

表1 AZM和AZM-d3的质谱参数Table 1 MS parameters for AZM and AZM-d3

1.4 样品前处理

称取1 g(精确至0.000 1 g)饲料样品，置于50 mL带盖离心管中，加入1 mL水浸润，加入1 μg/mL内标25 μL，加入10 mL乙腈超声提取30 min，8 000 r/min离心10 min，收集上清液于50 mL聚丙烯离心管，沉淀物加入10 mL乙腈重复提取1次，合并上清液，45 ℃水浴氮气浓缩至3 mL，待净化。

将MCX柱置于固相萃取装置上，分别用3 mL甲醇、3 mL水活化，上样量2 mL，依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，负压抽干，3 mL 15%的氨化甲醇洗脱，氮气吹干，2 mL 90%的甲醇水溶液溶解残渣，0.22 μm滤膜过滤，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 定性、定量离子对的确定

正离子模式条件下，对AZM和AZM-d3进行母离子扫描和子离子扫描，由所得质谱图确定AZM和AZM-d3的MRM通道分别为m/z749.6>591.3，m/z749.6>158.0和m/z752.5>594.2，AZM和AZM-d3的MRM通道与Filist等[15]报道一致。因此AZM的定性离子对为m/z749.6>591.3和m/z749.6>158.0，由于m/z749.6>591.3的相对丰度高，被确定为AZM的定量离子对。根据欧盟2002/EC/657[16]指令要求，该方法的定性需要满足以下条件：①全扫描时，所选择的离子的相对丰度超过浓度相当的标准溶液离子相对丰度的10%；②特征离子色谱峰的信噪比(S/N)应在 3∶1 以上；③针对HPLC-MS/MS的检测方法，1个母离子为1.0个识别点，2个对应的子离子为2×1.5个识别点，方法应满足4个识别点的要求。在同时满足上述3个条件时，可判断样品中存在AZM。而定量分析是采用内标法，以标准品MRM色谱峰面积/同位素内标MRM色谱峰面积对标准品AZM浓度/同位素内标浓度作标准曲线进行。本实验对AZM添加量为1 mg/kg的饲料样品测定，发现AZM的出峰时间与标准品一致，特征离子的丰度与标准品基本一致，因此本方法可用于配合饲料中AZM的确证检测。

2.2 流动相的选择

分别选用乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈-50 mmol/L乙酸铵水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液和甲醇-50 mmol/L乙酸铵水溶液作流动相，其他色谱-质谱条件同“1.3”所述，对质量浓度为50 ng/mL的混合标准品进行测定，以标准品的响应值和分离效果为评判依据，确定最佳流动相组成。结果表明，采用甲醇-50 mmol/L乙酸铵水溶液作流动相时的信号响应值最高，分离效果最好。实验结果与文献[15,17-18]一致。由于流动相组成会显著影响分析物的离子化效率，添加一定量的乙酸铵和甲酸有利于化合物的离子化和峰形的改善，本实验以甲醇-50 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相时，能提高信号的响应值，提高方法的灵敏度，且色谱峰无拖尾，因此本方法选其作为流动相。

2.3 样品提取试剂的确定

AZM属于亲脂类化合物，极性小，不溶于水，易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙腈、乙醚等有机溶剂。实验分别选择甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙酸乙酯作为提取溶剂，以响应值为评判依据，确定最佳的提取试剂。按照“1.4”前处理方法和“1.3”色谱-质谱条件，对添加浓度为1 mg/kg的质控样品进行测定。结果表明，使用乙腈提取AZM的回收率最高，且提取液澄清，浓缩时间最短，满足提取和后续净化的要求，而与Filist等[15]采用叔丁基甲醚-正己烷(50∶50)为提取溶剂的处理方法相比，本方法更环保和安全。

表2 不同SPE柱的保留率与回收率Table 2 Retention rates and recoveries of different SPE column

2.4 样品净化方法的优化

2.4.1 固相萃取柱的选择 SPE能有效去除样品中的杂质，根据 SPE 柱填料的种类不同，可分为正相柱、反相柱、离子交换柱、吸附柱和混合柱等。实验以MCX，C18，HLB 3种SPE柱分别净化1 mg/kg的质控样品，考察其保留和绝对回收率，结果见表2。结果表明HLB柱未能全部富集样品中AZM，出现穿漏现象，绝对回收率最低，MCX和C18柱的绝对回收率差别小，均能较好富集样品中的AZM，但是吴献花、张红等[19-20]使用C18柱净化尿液、血浆中的AZM时，发现柱中液体流干会严重影响回收率。考虑到AZM属于弱碱性化合物[21]，MCX萃取柱具有反相阳离子交换双重保留性能，对弱碱性化合物具有良好的保留能力，绝对回收率最高，因此，本实验最终选择MCX萃取柱为固相萃取柱。

2.4.2 洗脱溶剂中氨水比例和洗脱体积的选择 选择氨化甲醇为洗脱溶剂，以AZM绝对响应值为评价依据，确定MCX柱氨化甲醇最佳洗脱比例和洗脱液的洗脱体积。结果表明，当甲醇中氨水浓度为15%时，AZM的响应值最高。采用MCX净化，洗脱液pH值应大于AZM的pKa 2个值，AZM的pKa为8.795，本实验使用的10%，15%，20%，25%氨化甲醇的pH值分别为9.86，11.93，13.75和14.00，随着洗脱液pH值的升高，AZM的响应值逐渐降低，可能是由于AZM在高pH值的溶液中发生了降解。当洗脱液体积从3 mL增至6 mL时，AZM的响应值差异不显著(P>0.05)，说明3 mL氨化甲醇溶液可将AZM洗脱完全。因此本实验选择3 mL的15%氨化甲醇作为洗脱液。

2.5 方法学验证

2.5.1 方法的选择性 采用已建立的HPLC/MS/MS法分别测定空白育肥猪配合饲料样品、空白样品加入AZM标准品和AZM-d3的质控样品，平行测定6次，进行方法选择性评估，结果如图1。结果表明，AZM和AZM-d3保留时间处未见干扰色谱峰。因此方法能准确鉴别配合饲料中AZM和其他杂质，无潜在干扰物质，选择性强。

2.5.2 方法的遗留影响 为考察高浓度样品先于低浓度样品上机对低浓度样品MRM的影响，本实验先分析高浓度(225 μg/L)的质控样品后再对空白饲料样品进行分析，重复6次。结果表明，先分析高浓度样品再分析低浓度样品时，低浓度样品未发现高浓度样品的AZM的干扰峰，因此，本方法无高浓度样品遗留分析物的影响。

2.5.3 方法的基质效应 分别采用空白饲料的基质液和流动相制备0.5，1，5，10 mg/kg质控样品(n=6)，测定的AZM峰面积分别标识为Am和Ar，按照ME=Am/Ar×100%计算AZM的基质效应。分别采用空白饲料的基质液和流动相配制25 ng/mL 的AZM-d3(n=6)，计算AZM-d3的基质效应。

AZM和AZM-d3的基质效应计算值分别为(99.1± 1.4)%和(102.7± 1.2)%，RSD分别为1.4%和1.2%。结果表明，AZM和AZM-d3的基质效应和RSD值满足欧盟 2002/657/EC 规定的要求，方法的基质干扰小。

2.5.4 方法的线性、检出限及定量下限 为使标准溶液与样品溶液具有相似的离子化环境和消除基质效应的影响，本实验采用基质匹配标准曲线法进行定量，以空白样品提取液作为标准溶液的稀释液，配制标准溶液，并绘制标准曲线进行定量分析。在样品提取液中分别添加1，10，50，125，150，200，250 μg/L的AZM标准工作液，AZM-d3浓度为25 μg/L，以标准品的MRM色谱峰面积/内标MRM色谱峰面积(y)对标准品质量浓度/内标质量浓度(x)绘制标准曲线(内标法)。得到AZM的线性范围为1～250 μg/L，线性方程为y=1.833x-0.144，相关系数(r2)为0.999 1。

制备0.5 mg/kg的质控样品，按照“1.4”过程处理，稀释上机液，上机测定，以分析样品的信噪比(S/N)≥3和信噪比(S/N)≥10分别确定本方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)。结果表明，育肥猪配合饲料中AZM的LOD为2.8 μg/kg，LOQ为8.4 μg/kg。谭亚亚[22]、贾有志等[23]采用HPLC-MS/MS法分别测定人血浆、鸡肉中AZM，其LOD分别为2.37 ng/mL和0.3 μg/kg。本文建立的饲料中AZM测定方法的检出限与人血浆的HPLC-MS/MS法相当，且前者的基质杂质繁多，测定难度大于血液样品。

2.5.5 方法的回收率与精密度 本实验以空白饲料为样品，设计了0.5，1，5，10 mg/kg 4个添加水平，每个添加水平重复测定6 个样品，分别处理两批，测定AZM的回收率和相对标准偏差，结果见表3。结果表明，育肥猪配合饲料样品的加标回收率为90.7%～106.6%，批内和批间精密度分别为0.58%～5.4%和3.1%～5.4%，其回收率和精密度满足欧盟2002/657/EC规定的回收率应为85%～115%、相对标准偏差(RSD)应小于15%的要求。因此，本方法能准确测定饲料中的AZM。

表3 饲料中AZM批内、批间的回收率及相对标准偏差Table 3 Recovery and RSD of calibration samples for azithromycin in formula feed for fattening pig

2.6 方法的应用

应用本文建立的方法，分析了四川省育肥猪配合饲料中的AZM。按照NY/T1897-2010标准采集四川省1个省会城市，14个地级市，地域涵盖了四川省东、西、南、北部共54个育肥猪养殖场的饲料样品，其中成都市6份，内江市9份，南充市1份，绵阳市10份，广元市1份，达州市3份，乐山市5份，资阳市2份，德阳市2份，宜宾市2份，眉山市9份，泸州市3份，广安市1份，每个养殖场取商品饲料(槽料)样品1份(约500g)。分析结果表明54份配合饲料样品中均未检出AZM。其原因可能为采集到的饲料中未添加AZM，但不排除养殖户通过其他方式违规使用AZM，例如肌肉注射[24]和饮水或饲喂时小范围拌料。因此，可通过增加样本数及覆盖面，扩大采样途径，从而更全面地评价饲料中AZM的安全性。

3 结 论

本文通过对提取溶剂、净化方法以及色谱-质谱检测条件的优化，建立了饲料中AZM的HPLC-MS/MS检测方法。该方法灵敏度高，选择性强、基质干扰小，使用同位素内标定量，进一步提高了方法的准确性，可用于配合饲料中AZM的测定。

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Determination of Azithromycin in Formula Feed for Fattening Pigs by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

TANG Xiang1，ZHAO Li-jun2,3，LUO Cheng1,WU Cai-mei1*，YAN Shan-shan1，LIU Guang-mang1，LIN Yan1，WU De1

( 1.Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition and Feedstuffs of China Ministry of Agriculture，Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of Sichuan Province，Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Livestock and Poultry Products (Chengdu) 610041，China；3.College of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065,China)

A method was developed for the determination of azithromycin in formula feed for fattening pigs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The sample was extracted with acetonitrile under ultrasonic assistance.Oasis MCX solid-phase extraction column was used for purification，and the chromatographic separation was performed on a Hypersil BDS C18column(2.4 μm，100 mm×2.1 mm) with gradient elution using 0.05 mol/L ammonium acetate-methanol(1∶9) as mobile phase.The detection of azithromycin was performed with positive ion under multiple reaction monitoring(MRM) mode.The internal standard isotope dilution method was used for quantification.A good linearity(r2=0.999 1) was obtained for azithromycin in the range of 1-250 μg/L.The limit of detection(LOD，S/N≥3) and the limit of quantitation(LOQ，S/N≥10) of azithromycin in the formula feed were 2.8 μg/kg and 8.4 μg/kg，respectively.Average recoveries ranged from 87.0% to 106.6% for the formula feed at spike levels of 0.5，1，5，10 mg/kg.The intra-RSDs for azithromycin were 0.58%-5.4% and the inter-RSDs were 3.1%-5.4%.The method is accurate and sensitive，and the matrix interference is small.The method could be applied in the determination of azithromycin in formula feed.

liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)；azithromycin；fattening pig；formula feed

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.011

2016-09-20；

2016-10-19

四川科创饲料产业技术研究院(2013NZ0054)；四川饲料产业分析检测公共服务平台(009Z0811)资助项目

O657.63；O629.5

A

1004-4957(2017)03-0361-06

*通讯作者：吴彩梅，硕士，高级实验师，研究方向：饲料安全检测技术及饲料资源开发利用，Tel:028-86291592，E-mail：zhuomuniao278@163.com