羟基红花黄素A对脑缺血再灌注后缺血半暗带自噬活性的调节作用*

龚 哲， 张晓旎， 李红红， 黎祥喷， 彭 英， 潘经锐

(中山大学孙逸仙纪念医院神经科，广东 广州 510120)

羟基红花黄素A对脑缺血再灌注后缺血半暗带自噬活性的调节作用*

龚 哲， 张晓旎， 李红红， 黎祥喷， 彭 英， 潘经锐△

(中山大学孙逸仙纪念医院神经科，广东 广州 510120)

目的： 探讨脑缺血再灌注后羟基红花黄素A(hydroxysafflor yellow A，HYSA)对缺血半暗带自噬活性的调控机制。方法：构建雄性SD大鼠脑缺血90 min再灌注模型，分为假手术组、脑缺血再灌注(cerebral ischmia/reperfusion，I/R)组、I/R+HSYA组和假手术+HSYA组，分别在再灌注后6 h、1 d、3 d和7 d对大鼠进行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score，mNSS)，同时检测缺血半暗带的自噬活性、凋亡及干扰素β(IFN-β)表达。结果：与假手术组比较，I/R组缺血半暗带在6 h～7 d内可见LC3-Ⅱ蛋白表达增高及SQSTM1/P62蛋白降解，提示自噬激活；与I/R组比较，I/R+HSYA组的自噬活性在1 d和3 d时明显升高(P<0.05)，7 d时则明显降低(P<0.05)。同时，I/R组的IFN-β表达较假手术组在6 h时升高(P<0.05)，1 d和3 d时降低(P<0.05)，7 d时恢复正常；而I/R+HSYA组的IFN-β表达在1 d和3 d时明显高于假手术组和I/R组(P<0.05)，并且3 d时的细胞凋亡少于I/R组，mNSS评分自4 d起明显低于I/R组(P<0.05)。结论：HSYA可动态调节缺血半暗带的自噬活性和IFN-β表达，从而改善脑缺血再灌注损伤。

脑缺血再灌注损伤； 羟基红花黄素A； 自噬； 干扰素β。

脑卒中已经成为目前世界上最主要的致残和致死原因[1-2]，其中缺血性脑卒中约占87%[1]。对于急性脑梗死，发病4.5 h内的静脉溶栓[3]和6 h内的机械取栓术[4]是临床上唯一证实有效的治疗方法，然而都会导致脑缺血再灌注(ischmia/reperfusion，I/R)损伤[5]。羟基红花黄素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)是从传统中药红花中提取的一种活性单体，近来被发现可有效改善脑缺血再灌注损伤[6-7]，但机制尚未完全阐明。自噬是病理情况下细胞自我保护的一个重要途径，有文献报道HSYA可激活脑缺血再灌注后72 h的脑组织自噬活性[8]。然而，自噬也是一把“双刃剑”，脑缺血不同时期的自噬对神经细胞的转归有截然不同的作用[9]。因此，本研究旨在阐明HSYA对脑缺血再灌注后缺血脑组织自噬活性的调控作用，以阐明HSYA的神经保护机制。

材 料 和 方 法

1 动物和分组

取健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠88只，SPF级，体重280～320 g(由中山大学实验动物中心提供，动物合格证为No. 44002100004928)。动物随机分成4组(每组22只)：假手术组(sham组)、脑缺血/再灌注组(I/R组)、I/R+HSYA组以及sham+HSYA组。观察时点为再灌注后6 h、1 d、3 d、7 d和14 d。

2 主要试剂

羟基红花黄素A由山西华辉凯德制药有限公司提供；LC3A/B单克隆Ⅰ抗、SQSTM1/P62单克隆I抗及β-actin单克隆Ⅰ抗购自Cell Signaling Technology；TRIzol和PrimeScript RT Reagent Kit购自TaKaRa；All-in-One qPCR Mix Kit购自GeneCopoeia；qPCR引物购自Thermo。

3 主要方法

3.1 大鼠脑缺血再灌注模型的建立及给药方案 参照Longa的线栓法稍加改良[10]，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，术中从右侧颈外动脉插入栓线(购自北京西浓科技有限公司)18～20 mm、经颈内动脉至大脑中动脉起始部，构建右侧大脑中动脉闭塞模型，脑缺血90 min时拔出栓线实现再灌注。假手术组不插入栓线，其余步骤同上。大鼠清醒后出现左上肢瘫痪、转圈、追尾征等，取脑后未见肉眼出血为成功模型。假手术组无上述表现。

HSYA用前以无菌生理盐水稀释至3 g/L。对于药物治疗组，HSYA以6 mg/kg的剂量在大鼠脑缺血再灌注30 min时通过腹腔注射给药1次，此后每日重复给药1次至观察时点当天，给药时间为1～7 d。对于sham组和I/R组则以等量无菌生理盐水代替HSYA。

3.2 神经功能评分 以改良大鼠神经功能缺损评分(modified neurological severity score，mNSS)对大鼠脑缺血再灌注损伤的程度进行量化评分。mNSS评分从术后24 h开始，以避免麻醉对评分的影响。对所有大鼠每日评分1次，前7 d均在给药前30 min完成，撤药后、术后第14天重复评分1次。每组10只大鼠。mNSS评分包括运动试验、感觉试验、反射试验等，正常为0分，最严重为18分[11]。评分由不参与实验分组的第三方实验人员进行。

3.3 TUNEL染色检测半暗带区的细胞凋亡 再灌注3 d时，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，心脏灌注后迅速断头、取脑，以4%多聚甲醛固定脑组织，然后脱水、石蜡包埋和切片。按照DeadEndTMColorimetric TUNEL System (Promega)的说明书对脑切片进行TUNEL染色。最后在光学显微镜(OLYMPUS)下对切片的半暗带区域进行观察、拍照。

3.4 缺血半暗带组织分离方法 在各个观察时点当天，以颈椎脱臼法处死大鼠，迅速取脑，从额极向枕极方向将前、后各3 mm厚度的脑组织冠状切除，留下中间部分；以双侧大脑半球之间的中缝线作为参考，在缺血半球侧沿中缝线旁开2 mm处作一平行、垂直切口，再在中缝线旁“2点钟”方向再作一平行切口，所分离出的皮层组织主要为 “缺血半暗带”所在区域[12](图1)，-80 ℃保存。将分离到的组织的一半用于自噬活性检测，其余一半用于炎症因子表达检测。

Figure 1.Isolation of ischemic penumbra in the rat brain.

3.5 Western blot检测自噬活性 以Western blot法检测缺血半暗带组织的自噬指标LC3-Ⅱ和SQSTM1/P62的蛋白水平，内参照为β-actin。方法简述如下：将RIPA蛋白提取液(RIPA∶PMSF=100∶1)对皮层组织进行总蛋白提取，BCA法测蛋白浓度。以12% SDS-PAGE分离蛋白，再以湿法转膜将蛋白转至PVDF膜上；5%脱脂奶粉室温封闭后，分别以抗LC3A/B抗体(1∶1 000)、抗SQSTM1/P62抗体(1∶1 000)和抗β-actin抗体(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜；TBST冲洗3次，Ⅱ抗室温孵育1 h；TBST冲洗3次，以ECL化学发光法显影。以Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics)软件对Western blot结果进行灰度分析。

3.6 透射电镜检测缺血半暗带的自噬相关超微结构 再灌注6 h时，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，心脏灌注后迅速断头、取脑，按上法分离缺血半暗带组织，以2.5%戊二醛、4 ℃条件下固定过夜，然后送中山大学北校区电镜中心行电镜标本处理和透射电镜(Tecnai G2Spirit TWIN, FEI)检测。对于自噬体和自噬溶酶体的判断标准参考相关指南[13]：自噬体为双层膜结构(至少可见部分双膜结构)，内含结构完整的细胞器；自噬溶酶体为单膜结构，内含不同消化阶段的细胞器或胞质成分。

3.7 实时荧光定量PCR(qPCR)检测炎症因子的mRNA表达 按TRIzol操作说明书提取缺血半暗带区组织的总RNA并鉴定，再以PrimeScript RT Reagent Kit将RNA逆转录成cDNA。最后以All-in-One qPCR Mix Kit在罗氏荧光定量PCR仪(LightCycler 480Ⅱ, Roche)上对cDNA进行qPCR检测炎症因子的mRNA表达。IFN-β的上游引物序列为5’-TGCCCTCTCCATCGACTACA-3’，下游引物序列为5’-GCTGAGGTTGAGCCTTCCAT-3’；IL-1β的上游引物序列为5’-TGTGCAAGTGTCTGAAGCAG-3’,下游引物序列为5’-AGTCAAGGGCTTGGAAGCAA-3’；β-actin的上游引物序列为5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，下游引物序列为5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’。

4 统计学处理

以SPSS 19.0对结果进行统计分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。以Student’st检验对I/R和I/R+HSYA组的mNSS评分进行分析，以双因素方差分析(two-way ANOVA)法对4组的灰度分析和qPCR结果进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HSYA改善大鼠脑缺血再灌注后的神经功能缺损

观察时点内，sham组和sham+HSYA组大鼠均未见明显神经功能缺损。I/R组大鼠再灌注24 h的mNSS评分为6.45±1.18，随后逐日缓慢下降，至14 d时为3.50±0.60；而I/R+HSYA组大鼠再灌注24 h的mNSS评分为7.45±1.02，与I/R组比较差异无统计学显著性；但从4 d起，I/R+HSYA组的mNSS评分明显低于I/R组，至14 d时下降为1.20±0.33，与I/R组比较差异仍有统计学意义(P<0.01)，见图2。

Figure 2.The changes of the modified neurological severity score (mNSS) in the rats with different treatments. Hydroxy-safflor yellow A (HSYA) was intraperitoneally injected at a dose of 6 mg/kg per day for the first 7 d. mNSS was performed once a day on the first 7 conse-cutive days and repeated on the 14th day, started 24 h after surgery. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs I/R.

2 HSYA抑制缺血半暗带内的细胞凋亡

再灌注后第3天，sham组和sham+HSYA组的半暗带区的细胞形态正常，未见细胞凋亡；而I/R组可见细胞体积缩小以及大量TUNEL阳性细胞散在分布，提示凋亡形成；I/R+HSYA组的细胞形态基本正常，可见少量TUNEL阳性细胞，提示凋亡过程被抑制，见图3。

Figure 3.Apoptotic cells were stained by TUNEL on day 3. Brown staining indicated TUNEL-positive cells, while blue staining indicated nuclei.

3 HSYA动态调节缺血半暗带组织的自噬活性

从6 h～7 d时段里，I/R组缺血半暗带组织的LC3-Ⅱ蛋白表达均明显高于sham组，同时伴随SQSTM1/P62蛋白水平明显低于sham组(P<0.05)，提示自噬激活(图4)。透射电镜结果也显示，6 h时I/R组缺血半暗带区的胞浆内可见自噬体和自噬溶酶体均增多，证实自噬被激活(图5)。

I/R+HSYA组6 h时，可见LC3-Ⅱ蛋白表达较假手术组升高，但未见SQSTM1/P62蛋白降解；透射电镜也显示该时点半暗带区的胞浆内可见少量自噬体形成，但未见自噬溶酶体(图5)，提示自噬被激活后又中断。而在1 d和3 d时，I/R+HSYA组的LC3-Ⅱ蛋白表达均明显高于sham组，同时SQSTM1/P62蛋白水平降低甚至低于I/R组(P<0.05)，提示自噬激活并且激活强度高于I/R组。在7 d时，I/R+HSYA组可见LC3-Ⅱ蛋白水平低于I/R组，同时SQSTM1/P62蛋白水平高于I/R组，提示自噬活性受到抑制(图4)。

HSYA组在6 h时可见LC3-Ⅱ蛋白表达升高，但未见SQSTM1/P62蛋白降解，提示自噬过程中断；而在7 d时可见SQSTM1/P62蛋白降解，但无LC-Ⅱ蛋白表达升高，提示仅溶酶体降解过程被激活。

Figure 4.The dynamic changes of autophagic activation in the ischemic penumbras of the rats determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs I/R.

4 HSYA动态调节缺血半暗带内炎症因子的表达

I/R组缺血半暗带内的IL-1β表达在6 h～3 d时段内逐渐下降，但均明显高于sham组(P<0.05)，至7 d时恢复正常水平；而IFN-β在6 h时表达明显升高，随后在1 d和3 d时表达受抑制(P<0.05)，至7 d时恢复正常水平。

而I/R+HSYA组的IL-1β在6 h时表达高于sham组，但低于I/R组，而在1 d和3 d时IL-1β表达均明显低于I/R组(P<0.05)，7 d时恢复正常水平。IFN-β在1 d和3 d时表达明显升高，高于sham和I/R组(P<0.01)，其余时点与sham组比较无明显变化，见图6。

Figure 5.Autophagy detected by electron microscope in the penumbras of 4 groups at 6 h after reperfusion. Black arrows denote the representative presumed autophagosomes and autolysosomes. The scale bar=0.5 μm.

Figure 6.The mRNA expression of IL-1β and IFN-β in the penumbras of the rats detected by qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs I/R.

讨 论

HSYA是从传统中药红花中提纯得到的一个活性单体，既往的临床试验[14]和动物实验[6-7]均已证实HSYA可有效减轻脑缺血再灌注损伤，但其神经保护机制目前尚未完全阐明。

自噬在缺血性脑卒中病程中起“双刃剑”作用，既可保护神经细胞免于缺血损伤，也可导致细胞出现“自噬性死亡”[15]。如有学者报道自噬在脑缺血早期的激活起神经保护作用，而在后期的激活则起破坏作用[9]。这与我们的结果相符。我们的实验显示，HSYA在脑缺血再灌注后1 d和3 d时可明显增强I/R诱导的自噬活性，同时我们观察到3 d时I/R+HSYA组缺血半暗带区的细胞凋亡被明显抑制，随后自4 d起该组大鼠的神经功能缺损明显改善，这说明HSYA在前3 d所诱导的自噬是神经保护性的；由于脑缺血再灌注损伤后神经网络的重建需要一段时间，这可能是大鼠mNSS评分改善延迟出现的原因之一。而7 d时I/R+HSYA组的自噬活性被抑制，但伴随着神经功能的持续改善，这提示7 d时I/R诱导的自噬可能是破坏性的，而HSYA通过抑制该过程而持续发挥神经保护作用，因此在HSYA撤药后的14 d，I/R+ HSYA组的神经功能恢复程度仍然明显优于I/R组。当然，这需要将来进一步的实验证实。

脑缺血再灌注损伤的本质是炎症反应[16]。近年来的研究发现，病理情况下自噬和炎症信号途径的激活是互为因果的，如抗炎因子Ⅰ型干扰素(包括IFN-α、IFN-β和IFN-ω)已被证实在炎症发生时可通过激活自噬而保护宿主细胞[17]；另一方面，自噬可通过降解IL-1β前体、抑制IL-1β生成从而发挥抗炎作用[18]。我们的结果和这些发现也是相符的。我们发现，I/R组在6 h时即出现IFN-β表达升高，同时出现自噬的激活，而I/R+HSYA组则未见上述表现；随后在1 d和3 d时，I/R+HSYA组的IFN-β表达明显升高，同时伴随着自噬活性的强化和IL-1β表达的下降；至7 d时，I/R+HSYA组的IFN-β表达恢复基础水平，而自噬活性也被同时抑制。因此，HSYA可能是通过调节IFN-β的表达从而实现对自噬活性的调控，但这需要进一步的实验来证实。然而，IFN-β并非脑缺血再灌注损伤过程中自噬激活的唯一诱导因素，因为I/R组的IFN-β表达在1 d～7 d时段里是被抑制的，但仍可见明显的自噬激活。因为自噬是细胞内能量耗竭时、促使能量再生的一个重要旁路[13]，因此缺血本身即可诱导神经细胞发生自噬。

此外，HSYA组也可见轻微的自噬标记物表达改变，如6 h时仅LC3-Ⅱ蛋白表达升高，而7 d时仅SQSTM1/P62蛋白降解，这说明HSYA本身并不改变正常神经细胞的自噬活性，也间接提示HSYA不影响正常细胞的代谢功能。

综上所述，HSYA可通过动态调控脑缺血半暗带内的自噬活性和IFN-β表达从而诱导神经保护作用、减轻脑缺血再灌注损伤。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Modulation of autophagy in ischemic penumbra by hydroxysafflor yellow A after cerebral ischemia/reperfusion injury

GONG Zhe, ZHANG Xiao-ni, LI Hong-hong, LI Xiang-pen, PENG Ying, PAN Jing-rui

(DepartmentofNeurology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:panjingrui06@163.com)

AIM: To clarify the modulation of autophagy in ischemic penumbra by hydroxysafflor yellow A (HSYA) after cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury. METHODS: Male SD rats subjected to transient middle cerebral artery occlusion for 90 min were randomly divided into 4 groups: sham-operation (sham) group, cerebral I/R (I/R) group, I/R+HSYA group and sham+HSYA group. Modified neurological severity score (mNSS) was used to evaluate the neurological deficits of the rats at 6 h, 1 d, 3 d and 7 d after reperfusion, accompanied by the detection of autophagy, apoptosis and mRNA expression of IFN-β in ischemic penumbra. RESULTS: Compared with sham group, upregulation of LC3-Ⅱand degradation of SQSTM1/P62 were observed in I/R group, indicating the activation of autophagy after I/R. The activation of autophagy in I/R+HSYA group was significantly enhanced by HSYA on day 1 and day 3, and inhibited on day 7, as compared with I/R group (P<0.05). Besides, the mRNA expression of IFN-β in I/R group was significantly upregulated at 6 h, then downregulated on day 1 and day 3, and returned to basal level on day 7, as compared with sham group (P<0.05). In I/R+HSYA group, the mRNA expression of IFN-β was significantly upregulated on day 1 and day 3, accompanied by the inhibition of apoptosis on day 3 and the significantly decreased mNSS from day 4, as compared with I/R group (P<0.05). CONCLUSION: HSYA alleviates cerebral I/R injury by dynamically modulating the activation of autophagy and the expression of IFN-β in ischemic penumbra.

Cerebral ischemia/reperufuion injury; Hydroxysafflor yellow A; Autophagy; Interferon β

1000- 4718(2017)03- 0449- 06

2016- 09- 19

2016- 11- 26

广东省医学科研基金项目(No. A2016121)；民生科技研究项目2015(No. 201508020058)

△通讯作者 Tel: 020-34070569； E-mail: panjingrui06@163.com

R363.2; R743.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.011