腺病毒介导的shRNA下调PTEN表达对活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的影响*

郝礼森， 宋小杰， 章广玲， 王 静， 刘 博， 张朋垒， 张明婷， 靳丽敏

(华北理工大学 1附属医院消化内科， 2基础医学院，河北 唐山 063000)

腺病毒介导的shRNA下调PTEN表达对活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的影响*

郝礼森1△， 宋小杰1， 章广玲2， 王 静1， 刘 博1， 张朋垒1， 张明婷1， 靳丽敏1

(华北理工大学1附属医院消化内科，2基础医学院，河北 唐山 063000)

目的： 探讨腺病毒介导的shRNA下调第 10 号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)基因表达对体外培养的活化肝星状细胞(HSC)纤丝状肌动蛋白(F-actin)的影响。方法: 体外培养大鼠活化HSC(HSC-T6)，将携带靶向PTEN的RNA干扰序列[短发夹RNA(shRNA)]并表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN及仅表达GFP的对照空病毒Ad-GFP转染HSC，实时荧光定量PCR及Western blotting实验检测HSC的PTEN mRNA及蛋白表达；利用激光扫描共聚焦显微镜检测HSC的形态、F-actin的分布及荧光强度、伪足以及应力纤维的变化，并采用钙荧光探针Rhod-2/AM负载检测HSC内Ca2+浓度的变化。实验分为对照(control)组(在腺病毒转染步骤以DMEM代替腺病毒液)、Ad-GFP组(转染表达GFP的空病毒Ad-GFP)和Ad-shRNA/PTEN组(转染重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN)。结果: 靶向PTEN的shRNA成功转染体外活化HSC，显著下调HSC的PTEN mRNA及蛋白表达(P<0.05)；PTEN表达下调使活化HSC呈星形向四周伸展，F-actin排列紧密规则，数量增多，伪足充分向外伸展，应力纤维丝增长增粗；Ad-shRNA/PTEN组F-actin的荧光强度较control组及Ad-GFP组显著增强(P<0.05)，而control组与Ad-GFP组间差异无统计学显著性；Ad-shRNA/PTEN组HSC内Ca2+浓度较control组及Ad-GFP组明显升高(P<0.05)，而control组与Ad-GFP组间差异无统计学显著性。结论: PTEN表达下调使体外活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的形成及细胞骨架的重构增强，并增加了HSC内的Ca2浓度。

PTEN； RNA干扰； 肝星状细胞； 细胞骨架； 纤丝状肌动蛋白

肝纤维化是肝脏对各种损伤产生修复反应的病理过程，其特征是以胶原为主的细胞外间质在肝脏中的过度沉积，而肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是参与此过程的主要细胞。HSC活化时伸展为星芒状的肌成纤维样细胞，并在损伤部位黏附、迁移，进而表达各种细胞信号分子，产生大量细胞外间质[1-2]。研究发现细胞迁移与细胞骨架重构有关[3-4]。而肌动蛋白(actin)则是构成细胞骨架的重要骨架蛋白，其功能除了参与维持细胞的正常形态外，还参与调控细胞的应力纤维形成、黏附、迁移、凋亡、物质运输、跨膜信息传递以及受体聚集等[5]。Actin以可溶性的单体球形肌动蛋白(globular actin, G-actin)和聚合体纤丝状肌动蛋白(filamentous actin, F-actin)2种形式存在，且只有F-actin具有生物学活性作用[6]。而第 10 号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology detected on chromosome 10,PTEN)基因是迄今发现的第一个具有脂质磷酸酶活性及蛋白磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，其低表达或缺失可影响肿瘤细胞的细胞骨架重构[7-8]。近年来对PTEN的研究已从肿瘤领域逐渐延伸到非肿瘤领域，有研究发现大鼠纤维化肝组织及在体肝星状细胞中的PTEN表达均下调[9-10]。但PTEN表达下调对肝星状细胞骨架蛋白F-actin的影响仍不清楚。为此，本研究利用RNA干扰技术，将靶向PTEN的RNA干扰序列——短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)转染体外培养的活化HSC，构建HSC的PTEN低表达模型，以观察下调PTEN表达对活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的影响。

材 料 和 方 法

1 细胞与试剂

表型活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6及293A细胞购于中国医学科学院肿瘤医院；将冷冻保存的肝星状细胞复苏后接种于含10%胎牛血清(Biological Industries)DMEM(Gibco)完全培养基的细胞培养瓶中，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养并传代；携带靶向PTEN的shRNA并表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN由武汉浙玛生物技术公司协助构建，仅表达GFP的空病毒由第三军医大学祝善俊教授惠赠，通过反复感染293A细胞的方法进行扩增，并测定其滴度；荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC)标记的鬼笔环肽购于上海翊圣生物有限公司；DAPI及Triton X-100购于Sigma；荧光防淬灭封片剂购于Bioworld；钙荧光探针Rhod-2/AM购于Invitrogen；小鼠抗PTEN单克隆抗体购于Abcam；兔抗3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)单克隆抗体购于Affinity；Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG和逆转录反应体系均购于上海英俊生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG购于KRL。

2 方法

2.1 腺病毒转染体外活化的HSC 以含10%胎牛血清的DMEM培养液培养HSC，当细胞生长至80%融合时，以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为100进行腺病毒转染。确定所需病毒颗粒量(细胞数×MOI)，用不含血清及抗生素的DMEM培养液稀释后加入细胞培养瓶，使其均匀分布于培养瓶底部，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2 h，每隔20 min轻轻摇晃培养瓶以促进感染。2 h后补充适量完全培养基后继续培养至实验所需时间。分别于腺病毒转染HSC 12、24、48和72 h在倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光表达，并计算转染效率，48 h时转染效率>80%，48 h与72 h GFP阳性表达的HSC数量无明显差别，但感染72 h时细胞脱落现象更广泛，表明腺病毒转染HSC 48 h时转染效率已达到最高，后续实验将采用腺病毒转染48 h的HSC。于倒置荧光显微镜下观察HSC的荧光表达率达80%以上。实验分为对照(control)组(在腺病毒转染步骤以DMEM代替病毒液)、 Ad-GFP组(转染表达GFP的空病毒)和 Ad-shRNA/PTEN组(转染携带靶向PTEN的shRNA并表达GFP的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN)。

2.2 Western blotting实验检测HSC的PTEN蛋白表达 按上述实验分组及腺病毒转染方法将腺病毒转染体外活化HSC，腺病毒感染HSC 48 h，消化、收集上述各组细胞，提取细胞蛋白后应用BCA蛋白定量法测定蛋白含量；SDS-PAGE分离蛋白，于冰上湿转，含5% BSA的TBST中封闭2 h，加入小鼠抗PTEN单克隆抗体(1∶100)和兔抗GAPDH抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜后，TBST振摇洗膜 10 min×4次，以封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗膜 10 min×4次。加入ECL显色液避光1 min后放入生物分子成像仪进行免疫显色，所得图像用ImageJ 1.47H软件定量分析，结果以目的蛋白与GAPDH的积分吸光度值的比值表示。

2.3 实时荧光定量PCR技术检测HSC的PTEN mRNA表达 腺病毒感染HSC 48 h，消化并收集各组HSC，采用TRizol提取总RNA，反转录合成cDNA。PTEN及内参照GAPDH的引物均由上海生工生物公司协助设计合成。引物序列：PTEN的上游引物为5’-TCCTGCAGAAAGACTTGAAGGT-3’，下游引物为5’-GCTGTGGTGGGTTATGGTCT-3’，扩增产物大小为182 bp；GAPDH的上游引物为5’-GGCTCATGACCACAGTCCAT-3’，下游引物为5’-ACATTGGGGGTAGGAACACG-3’，扩增产物大小为202 bp。在Mastercycler ep RealPlex4实时荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增。SYBR反应体系20 μL。PCR 的反应条件：为 95 ℃ 3 min； 95 ℃ 12 s， 58 ℃ 40 s， 72 ℃延伸30 s，共40个循环。各反应体系扩增后，定量PCR仪显示S形扩增曲线平滑完整，上升迅速陡峭并很快到达平台期，熔解曲线单峰，提示扩增产物单一，无非特异性扩增。采用相对定量2-ΔΔCt法比较各组HSC的PTEN mRNA表达[11]。

2.4 HSC的形态、应力纤维、伪足及F-actin的观察 腺病毒感染HSC 48 h，吸去上述各组细胞培养液，加入PBS清洗细胞5 min；吸去PBS，加入4%多聚甲醛溶液进行细胞固定，室温固定30 min；吸去多聚甲醛，室温下PBS清洗细胞3次，每次5 min；室温条件下，加入0.1% Triton X-100溶液透化处理5 min；室温条件下，用PBS清洗细胞3次，每次5 min；吸去PBS，用滤纸轻轻吸去玻片上的液体，滴加200 μL 2% BSA封闭液，室温下封闭15 min；吸去封闭液，PBS洗涤3次，每次5 min；吸去PBS，滴加1∶125稀释的TRITC标记鬼笔环肽工作液200 μL，覆盖住培养皿中央圆孔处的细胞，室温避光孵育2 h；PBS清洗3次，每次5 min；用浓度为5 mg/L的 DAPI溶液复染细胞核5 min；用PBS清洗片刻后，在培养皿底部滴加荧光防淬灭封片剂使其完全覆盖住中央圆孔处，置于激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)下，随机选取6个视野进行观察并分析荧光图像。

2.5 肝星状细胞内Ca2+浓度测定 腺病毒感染HSC 48 h，取出各组细胞，除去培养基，以 HBSS溶液冲洗细胞3次；加入配制的浓度为5 μmol/L的Rhod-2/AM工作液，充分覆盖培养皿底部中央圆孔处的细胞；置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱避光孵育30 min，除去Rhod-2/AM工作液；以HBSS溶液冲洗细胞3次，置于LSCM下，随机选取6个视野进行观察，激发波长557 nm，发射波长581 nm，以荧光强度表示细胞内Ca2+水平，Ca2+浓度越大，荧光强度越强。

3 统计学处理

用SPSS 17.0统计学软件处理，实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示，3组样本均数间差异比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 靶向PTEN的shRNA下调体外活化HSC的PTEN表达

腺病毒感染HSC 48 h，实时荧光定量PCR检测各组HSC的PTEN mRNA表达，以control组PTEN的mRNA表达量为1，则Ad-GFP组及Ad-shRNA/PTEN组的PTEN mRNA表达量分别为control组的92%和64%，Ad-shRNA/PTEN组PTEN mRNA表达量明显低于control组及Ad-GFP组(P<0.05)；而control组与Ad-GFP组之间差异无统计学显著性。Western blotting实验检测各组HSC的PTEN蛋白表达，Ad-shRNA/PTEN组(1.088±0.036)明显低于control组(1.438±0.038)及Ad-GFP组(1.413±0.058)(P<0.05)，而control组与Ad-GFP组之间的差异无统计学显著性。上述结果显示靶向PTEN的shRNA成功转染体外活化HSC，敲减了HSC的PTEN表达，成功构建了HSC的PTEN低表达模型，见图1、2。

2 PTEN低表达对HSC形态、应力纤维、伪足及F-actin的影响

HSC经TRITC标记的鬼笔环肽染色后，于LSCM下观察，可见细胞内F-actin被激发出红色荧光。Control组与Ad-GFP组HSC内可见应力纤维，纤维丝短而稀疏，排列不规则，很少伪足形成；转染携带靶向PTEN的shRNA的重组腺病毒48 h，可观察到HSC内F-actin排列紧密规则，纤维丝明显增粗增长，伪足向外充分延伸。Ad-shRNA/PTEN组F-actin的荧光强度较control组及Ad-GFP组显著增强(P<0.05)，而control组与Ad-GFP组间差异无统计学显著性，见图3、表1。

Figure 1.PTEN mRNA expression of HSC in each group at 48 h after adenovirus infection. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Ad-shRNA/PTEN group.

Figure 2.PTEN protein expression of HSC was detected by Western blotting at 48 h after adenovirus infection. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Ad-shRNA/PTEN group.

3 PTEN低表达对HSC内Ca2+浓度的影响

HSC经Rhod-2/AM钙荧光探针处理后，于LSCM下观察，可见胞浆内呈现红色荧光。Ad-shRNA/PTEN组HSC内Ca2+浓度较control组及Ad-GFP组明显增强(P<0.05)，而control组与Ad-GFP组间差异无统计学显著性，见图4、表1。

*P<0.05vsAd-shRNA/PTEN group.

讨 论

细胞骨架是指细胞中的蛋白纤维网状结构，包括微管、中间纤维和微丝三部分。Actin是微丝的主要组成成分,也是构成细胞骨架的重要骨架蛋白，F-actin则是其具有生物学活性作用的形式。F-actin不仅参与细胞形态和空间结构的维持，而且在细胞附着、迁移、凋亡、物质运输、跨膜信息传递以及受体的聚集等许多细胞生命活动中发挥重要作用[12-14]。当受到外界刺激时，细胞通过多种信号转导途径介导F-actin发生重构，形成应力纤维、伪足，细胞形态也随之改变。而PTEN是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，编码的蛋白产物是具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的双重特异性磷酸酶。已有研究发现，PTEN突变可影响胶质母细胞瘤细胞骨架蛋白F-actin的重构，表现为优先形成丝状及层状伪足[15]。但PTEN低表达对在肝纤维化病理过程中发挥重要作用的肝星状细胞骨架蛋白F-actin的影响尚不清楚。为此，本实验利用RNA干扰技术，以腺病毒为载体，将靶向PTEN的 shRNA转染体外培养的活化HSC，在证实靶向PTEN的 shRNA成功转染于HSC并下调PTEN表达后，应用TRITC标记的鬼笔环肽和LSCM成像技术，观察了HSC的形态、F-actin分布、应力纤维、伪足及F-actin荧光强度变化。结果显示，下调PTEN表达后HSC内F-actin数量增多，荧光强度增强，应力纤维丝增长增粗，伪足充分向外延伸。这提示PTEN表达下调使体外活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的形成及细胞骨架的重构增强。而我们前期的研究已发现大鼠纤维化肝组织及在体肝星状细胞的PTEN表达均下调[9]，或许PTEN低表达使活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的形成及细胞骨架的重构增强是PTEN参与肝纤维化病理过程的机制之一。

Actin以可溶性的单体G-actin和聚合体的F-actin存在，2种形式的actin可以根据细胞功能状态相互转化，维持动态平衡，而细胞内 Ca2+浓度可调节这一平衡[6]。并且，Ca2+作为重要的细胞内第二信使，在细胞兴奋、增殖、收缩等一系列细胞功能中也发挥重要作用[16]。为明确PTEN低表达对肝星状细胞内Ca2+浓度的影响，本研究在证实靶向PTEN的 shRNA下调HSC的PTEN表达后，也检测了肝星状细胞内Ca2+浓度。结果显示， PTEN低表达可显著升高肝星状细胞内Ca2+浓度，这提示PTEN低表达增强肝星状细胞F-actin的形成与其细胞内Ca2+浓度升高有关。

综上所述，本研究发现下调PTEN表达可引起体外活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的形成及细胞骨架的重构增强，并导致活化HSC内Ca2+浓度升高，但发生上述变化的具体机制及相关信号转导还有待于进一步研究。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Effects of adenovirus-mediated shRNA targetingPTENon cytoskeletal protein F-actin in activated hepatic stellate cells

HAO Li-sen1, SONG Xiao-jie1, ZHANG Guang-ling2, WANG Jing1, LIU Bo1, ZHANG Peng-lei1, ZHANG Ming-ting1, JIN Li-min1

(1DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedHospital,2SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China.E-mail:haolisen125@163.com)

AIM: To investigate the effects of down-regulation of phosphatase and tensin homology detected on chromosome 10 (PTEN) gene by adenovirus-mediated short hairpin RNA (shRNA) on cytoskeletal protein filamentous actin (F-actin) in activated hepatic stellate cells (HSC)invitro. METHODS: The activated HSC (HSC-T6 cells) were culturedinvitroand transfected with recombinant adenovirus carrying shRNA targeting PTEN and expressing green fluorescent protein (GFP), Ad-shRNA/PTEN， and the control adenovirus expressing GFP only， Ad-GFP. The expression of PTEN in the HSC was measured by Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR). Under the laser scanning confocal microscope, the cellular morphology, distribution and fluorescence intensity of F-actin, stress fibers and pseudopodia in activated HSC were examined by phalloidin marked with tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). The concentration of intracellular Ca2+in the HSC was detected by calcium fluorescent probe Rhod-2/AM. The HSC were divided into control group (using DMEM instead of adenovirus for transfection), Ad-GFP group (the HSC were transfected with the empty adenovirus expressing GFP alone) and Ad-shRNA/PTEN group (the HSC were transfected with recombinant adenovirus Ad-shRNA/PTEN). RESULTS: The shRNA targetingPTENwas successfully transfected into activated HSCinvitro, and significantly down-regulated the expressions of PTEN at protein and mRNA levels in the HSC (P<0.05). The HSC withPTENknockdown showed starlike and stretched to the surrounding. The F-actin of the cells was closely arranged in order and had the increasing number. The pseudopodia fully extended outward, and stress fibers got larger and thicker. The fluorescence intensity of F-actin in Ad-shRNA/PTEN group significantly enhanced (P<0.05) compared with control group and Ad-GFP group, while no significant difference between control group and Ad-GFP group was observed. Intracellular Ca2+concentration of the HSC in Ad-shRNA/PTEN group was statistically higher (P<0.05) than that in control group and Ad-GFP group, and no significant difference between control group and Ad-GFP group was found. CONCLUSION: Down-regulation of PTEN expression promotes the formation of F-actin and reorganization of cytoskeleton in activated HSC, and increases the intracellular Ca2+concentration in activated HSCinvitro.

PTEN; RNA interference; Hepatic stellate cells; Cytoskeleton; Filamentous actin

1000- 4718(2017)03- 0557- 06

2016- 08- 01

2016- 12- 01

河北省自然科学基金资助项目(No. H2013209327); 中国肝炎防治基金会天晴肝病研究基金资助项目(No. CFHPC20132078)

△通讯作者 Tel: 0315-2308012; E-mail: haolisen125@163.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.030