正交试验对密蒙花总黄酮分离纯化工艺的优化

潘乔丹++韦沛琦++黄元河++陆海峰++韦仲广++黎斯敏++黄锁义

摘要：优选密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）总黄酮的分离纯化工艺条件。以总黄酮含量为指标，通过静态和动态试验确定较佳树脂，并通过单因素试验和正交试验优化密蒙花中总黄酮的分离纯化工艺。结果表明，采用AB-8型吸附树脂纯化效果较佳，其优化的密蒙花总黄酮分离纯化工艺为上样浓度2.24 mg/mL，用3 BV 50%乙醇洗脱，洗脱流速为1.5 mL/min；处理后所得干膏中总黄酮的纯度为71.31%。其优选的工艺条件简单可行，可为工业化纯化密蒙花总黄酮提供参考。

关键词：密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）；总黄酮；正交試验；分离纯化

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5894-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.042

The Technology of Separation and Purification of Total Flavones from Buddleja officinalis Maxim by Orthogonal Experiment

PAN Qiao-dan， WEI Pei-qi， HUANG Yuan-he， LU Hai-feng， WEI Zhong-guang， LI Si-min， HUANG Suo-yi

（Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

Abstract： To optimize the technology of separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim. With the content of flavones as index， the optimum resin was determined by static experiments and dynamic experiments， and the technology of separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim was investigated by single factors test and orthogonal test. The results showed that AB-8 macroporous adsorption resin had better purification effect than others. The optimized technology of separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim were found to be a sample concentration of 2.24 mg/mL， elution with 3BV 50% ethanol， and flow rate of 1.5 mL/min. After purification， the total flavones of extractum was up to 71.31%. The optimal technology was simple and practicable， which would provide reference for the industrial separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim.

Key words： Buddleja officinalis Maxim； total flavones； orthogonal experiment； separation and purification； optimization

密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）又名小锦花、蒙花、黄饭花等，为马钱科植物密蒙花的干燥花蕾及花序。其味甘，性微寒，有清热养肝、明目退翳之功，用于治疗目赤肿痛、肝虚目昏、视物昏花等病症[1]。密蒙花中含有的黄酮类化合物主要有刺槐素、木犀草素、芹菜素、蒙花甙、密蒙花新甙、木犀草素-7-O-葡萄糖甙、木犀草素-7-O-芸香糖甙、秋英甙、芹菜素-7-O-芦丁糖甙等[2，3]。具有类雄激素作用、抗炎、降血糖、免疫调节、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等作用，目前主要运用于干眼症、糖尿病和糖尿病视网膜病变以及肿瘤等疾病[4]。本试验采用静态吸附和动态吸附方法优选出较佳树脂，并通过单因素试验和正交试验优化密蒙花总黄酮的分离纯化工艺，为开发密蒙花资源及其总黄酮制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

密蒙花采于广西百色，干燥粉碎后备用；芦丁标准品由中国药品生物制品检定所提供，批号为100080-200707；AB-8和D-101大孔树脂由河北沧州宝恩化工有限公司提供，聚酰胺树脂由上海润捷化工公司出品提供；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

TU-1800型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FA1004型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣仪器厂）；HH-4型数显恒温水浴锅（江苏荣华仪器制造有限公司）；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制 将芦丁标准品配制成不同的浓度，采用硝酸铝显色法[5，6]显色后于分光光度计的510 nm波长处测吸光度，以吸光度A与浓度C进行直线回归，得回归方程为A=9.158 1C+0.0031 2，r=0.999 6。

1.3.2 密蒙花总黄酮的提取 称取密蒙花粉末200 g，用石油醚（60～90 ℃）回流去脂2次，每次1 h，加75%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至无液滴出现，制得密蒙花总黄酮提取液，冷藏备用。

1.3.3 密蒙花总黄酮含量测定 取样品液稀释到一定质量浓度，于510 nm處测定吸光度，按回归曲线方程计算得样品液中总黄酮的质量浓度为22.38 mg/mL（原药材含量为476.19 mg/mL）。

1.3.4 大孔树脂的预处理[7] 称取AB-8、D-101和聚酰胺树脂各200 g，用95%乙醇浸泡24 h，湿法装柱，用95%乙醇冲洗至流出液不浑浊为止，再用蒸馏水冲洗至无醇味，用体积分数5%HCI溶液浸泡24 h，然后用蒸馏水冲洗至pH为中性，接着用体积分数5%的NaOH溶液浸泡24 h，最后用蒸馏水冲洗至pH为中性，晾干，备用。

2 结果与分析

2.1 静态吸附行为的考察[8，9]

取已处理好的吸附树脂各5 g（湿质量），置100 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入上样液10 mL，振荡24 h，滤过，滤液适当稀释后测定吸光度，计算静态吸附量和吸附率。在吸附饱和的树脂中分别加入95%乙醇10 mL于锥形瓶中，振摇24 h，滤过，同法测定吸光度，计算滤液中总黄酮的质量浓度，并得到解吸量和解吸率，结果见表1。从表1可以看出，AB-8吸附树脂的吸附率和解吸率均为最高，其静态吸附密蒙花总黄酮为1.665 mg/g树脂（湿质量）。

吸附量=（上样液总黄酮质量-水洗液总黄酮质量）/树脂质量

吸附率=（上样液总黄酮质量-水洗液总黄酮质量）/上样液总黄酮质量×100%

解吸量=醇洗液总黄酮质量/树脂质量×100%

解吸率=醇洗液总黄酮质量/（上样液总黄酮质量-水洗液总黄酮质量）×100%。

2.2 动态吸附行为的考察[10]

称取吸附树脂各5 g（湿质量）并湿法装柱，加入已知浓度的上样液，用蒸馏水洗至水洗液呈无色，再用95%的乙醇洗脱，收集洗脱液，分别测定水洗液和洗脱液中总黄酮的含量，计算树脂吸附量、吸附率、解吸量及解吸率，结果见表2。结果表明，AB-8吸附树脂对密蒙花总黄酮的吸附能力及洗脱能力均为最强，综合静态和动态的吸附、洗脱，AB-8吸附树脂更适合分离纯化密蒙花的总黄酮。

2.3 AB-8树脂纯化工艺条件的优化

2.3.1 上样液浓度的考察 将不同浓度的上样液以相同体积分别通过6根AB-8吸附树脂柱，用水洗至流出液近无色，收集流出液和水洗液，测定总黄酮含量，计算树脂吸附率，考察上样液对吸附效果的影响，结果见图1。由图1可知，随着上样液浓度的增加，总黄酮的吸附率逐渐增加，当上样液浓度超过2.24 mg/mL后，AB-8吸附树脂的吸附率变化不大，因此选择2.24 mg/mL上样液浓度进行优化试验。

2.3.2 洗脱速率的考察 称取已处理好的树脂6份装柱，取一定的上样量和上样体积，考察洗脱液流速对解吸效果的影响，结果见图2。由图2可知，随着洗脱液流速的增加，其解吸率先增加后下降，当洗脱液流速为2.0 mL/min时解吸率达到最大，因此选择洗脱速率为2.0 mL/min左右进行优化试验。

2.3.3 洗脱剂浓度的选择 称取已处理好的树脂5份，取一定体积的已知浓度的上样液进行动态吸附。吸附完成后，先用水洗脱至流出液为无色，再依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脱至流出液为无色。结果密蒙花总黄酮的洗脱量分别为0.273、3.073、3.580、3.696和3.797 mg/g，洗脱率分别为6.23%、70.34%、81.59%、84.57%和86.33%。从经济和安全方面考虑，取50%左右的乙醇为洗脱剂进行优化试验。

2.3.4 上样量的考察 称取已处理好的树脂5.0 g，上样液质量浓度为2.238 mg/mL，分段收集流出液共30份，每份5 mL，以总黄酮浓度为考察指标，绘制泄漏曲线（图3）。当流出液中总黄酮浓度达到上样液浓度的10%（0.223 8 mg/mL）时，称为泄漏点。当上样量为20 mL时，密蒙花总黄酮就已经明显泄漏了，因此确定最大上样量为20 mL。

2.3.5 洗脱剂用量的选择 将已处理好的树脂5.0 g装柱，上样液质量浓度为2.24 mg/mL上样液20 mL，用蒸馏水洗至无色，然后用30%乙醇洗脱，洗脱剂速率为2.0 mL/min，每份收集5 mL，共收集10份，以测定密蒙花总黄酮质量浓度为考察指标，绘制曲线，结果见图4。由图4可以看出，到第8份后，洗脱液中的总黄酮质量浓度已降得很低，说明总黄酮的洗脱已基本完全，此时洗脱剂用量为40 mL（约为5 BV），因而应取4 BV左右的洗脱剂用量进行优化试验。

2.4 正交试验对AB-8树脂纯化工艺[11]的优化

根据总黄酮的理化性质与大孔树脂的吸附特点，再结合上述单因素的试验结果，选取上样浓度、洗脱剂浓度、洗脱剂用量、流速为因素，以干膏中的总黄酮含量为指标，设计L9（34）正交试验，结果见表3。由表3可知，影响AB-8吸附树脂纯化密蒙花总黄酮工艺的因素依次为C>A>D>B。方差分析结果（表4）显示，A（上样浓度）、C（洗脱剂用量）和D（洗脱速率）对干膏中总黄酮含量影响极显著（P<0.01）。其纯化的最佳提取条件为A3B2C1D1，即上样浓度为2.24 mg/mL，用3 BV 50%乙醇洗脱，洗脱流速为1.5 mL/min。按此最佳纯化工艺条件重复操作3次，减压浓缩后真空干燥，测得浸膏中总黄酮纯度71.31%。

3 结论

密蒙花黄酮类化合物为密蒙花的主要有效成分，而用大孔吸附树脂在分离纯化中草药的有效成分中具有富集有效成分、减少杂质和节约成本等方面的优势。本研究通过静态试验和动态试验比较了AB-8、D-101和聚酰胺3种型号树脂，选取较佳的AB-8大孔吸附樹脂，并通过单因素和正交试验优化密蒙花中总黄酮的分离纯化工艺，其优化的分离纯化工艺为：上样浓度为2.24 mg/mL，用3 BV 50%乙醇洗脱，洗脱流速为1.5 mL/min；处理后所得干膏中总黄酮的纯度为71.31%，该工艺具有操作简单、成本较低、生产周期短、无污染等优点，适合应用于大规模的工业生产。

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