油橄榄果渣多酚分离纯化及抗氧化活性

谢碧秀 +马建英 +杨泽身+向亚楠 陈明霜

摘要：研究了6种大孔树脂对油橄榄果渣多酚的吸附性能，筛选出最佳树脂为XAD-16，进一步对油橄榄果渣多酚的分离纯化工艺进行了优化。最佳工艺为pH值4的油橄榄果渣多酚提取液浓度为0.3 mg/mL，上样流速为 2 BV/h，洗脱剂乙醇体积分数为80%，洗脱量为3 BV。对纯化后的油橄榄果渣多酚抗氧化活性进行了研究，结果表明，油橄榄果渣多酚具有较强的还原能力，对超氧阴离子自由基、亚硝酸盐具有良好的清除能力。

关键词：油橄榄果渣；多酚；纯化；抗氧化

中图分类号：TS201.2文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2017）05-0178-05

油橄榄（Olea europaea L.）主产地中海区域，为著名亚热带木本油料兼果用树种，栽培品种含丰富优质食用植物油——橄榄油[1]，享有植物油皇后的美誉[2]。自20世纪60年代起，油橄榄开始在中国引种，其中，甘肃省陇南市武都区是目前全国最大的油橄榄种植基地[3]。油橄榄榨油后的果渣、废水等生产副产物虽然富含多酚、苦苷等活性物质，但综合利用还有待开发。多酚类化合物广泛存在于许多植物中，研究证实，油橄榄多酚对DPPH自由基和羟基自由基都具有一定的清除能力[4-5]。国内关于油橄榄果渣、叶片、果实中多酚提取方法的研究已有较多报道[4-10]，但很少看到关于油橄榄果渣中多酚类物质分离纯化的报道。在前期油橄榄多酚提取方法研究的基础上，使用大孔树脂对提取液进行了分离纯化，进一步分析了油橄榄果渣多酚的抗氧化活性。

1材料与方法

1.1试验材料

油橄榄果渣由凉山州中泽新技术开发有限责任公司提供，果实经榨油脱水后产生的果渣立即装袋，真空包装，-20 ℃ 条件下保藏备用。

1.2试剂与仪器

试剂：蒸馏水；正己烷、无水乙醇、碳酸钠、Folin-Ciocalteu 试剂等均为分析纯，四川成都市科龙化工试剂厂；没食子酸标品，中国医药上海化学试剂公司；大孔吸附树脂XAD-7HP、XAD-16，罗门哈斯公司；大孔吸附树脂AB-8、HPD-200、HP-20、D101，四川成都市科龙化工试剂厂。

仪器：UV-18000紫外可见分光光度仪，翱艺仪器（上海）有限公司；SB-5200超声波清洗仪，宁波新艺生物科技股份有限公司；ATL-124分析天平，德国赛多利斯集团；DUG-924GA电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；RE-6000A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；玻璃层析柱，16 mm×30 mm；HL-2恒流泵，上海青浦沪西仪器厂。[LM]

1.3试验方法

1.3.1多酚提取浓缩物的制备

精确称取10 g经解冻后的果渣，以80%乙醇，料液比1 ∶[KG-*3]24，在250 W、50 ℃的水浴中超声45 min，收集上清液，于40 ℃下旋转蒸发除去溶剂得到棕红色的粗提液；将粗提液用25 mL正己烷萃取2次，正己烷层浓缩，回收正己烷，得油橄榄果渣提取物精制产品，并于 -20 ℃ 条件下保存备用。

1.3.2多酚含量测定

采用Folin-Cilcalteu比色法[11]在765 nm波长处测定不同浓度的没食子酸标准溶液的吸光值，以吸光度值（y）为纵坐标，标准溶液浓度（x）为横坐标，得到回归方程式y=5.169 7x（r2=0.999 0），没食子酸标品在0～0.275 mg/mL浓度范围内与吸光度呈良好线性关系。以试样替代没食子酸溶液测定吸光值，根据绘制的标准曲线方程计算多酚含量（以没食子酸计）。

1.3.3树脂筛选

通过测定7种树脂的吸附和解吸能力确定最佳树脂。准确称取经预处理，并经滤纸吸干后的6种树脂各2.000 g，分别置于250 mL具塞磨口三角瓶中，加入浓度为0.25 mg/mL的多酚粗提液40 mL，水浴振荡，（25 ℃、120 r/min）24 h后，過滤取上清液测定滤液体积和多酚的浓度，计算吸附率。将滤出的树脂加入80%的乙醇40 mL继续振荡8 h，计算解吸率。

1.3.5吸附动态试验

1.3.5.1pH值对吸附的影响

将最佳大孔树脂湿法装入5根相同型号的层析柱中，柱体积10 mL。将20 mL浓度为 0.25 mg/mL 的多酚提取液在pH值分别为3、4、5、6、7的条件下上柱，上柱速率为2 BV/h，以确定最佳pH值。

1.3.5.2上样流速对吸附的影响

取10 mL处理过的大孔树脂湿法装柱。然后将浓度为0.25 mg/mL、pH值4的多酚提取液20 mL用恒流泵分别以1、2、3、4、5 BV/h的速率上柱吸附，以确定最佳上样流速。

1.3.5.3上样浓度对吸附的影响

取10 mL处理过的大孔树脂湿法装柱。分别用20 mL pH值4，浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的多酚提取液上柱，流速为3 BV/h，以确定最佳上样浓度。

1.3.6解析动态试验

1.3.6.1乙醇浓度对洗脱效果的影响

取10 mL处理过的大孔树脂湿法装柱，按优选吸附条件进行上样吸附，收集流出液并测多酚含量；蒸馏水淋洗，然后分别用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，以3 BV/h的流速进行洗脱，洗脱体积为3 BV，以确定乙醇的最佳洗脱浓度。

1.3.6.2洗脱剂体积对洗脱效果的影响

取10 mL处理过的大孔树脂湿法装柱，按优选吸附条件进行上样吸附，收集流出液并测多酚含量；蒸馏水淋洗，80%乙醇分别以1、2、3、4、5 BV 的量进行洗脱，以确定乙醇洗脱的最佳体积。

1.3.6.3动态洗脱曲线的绘制

取10 mL处理过的大孔树脂湿法装柱，将20 mL多酚提取液按优选吸附条件上柱吸附，再用蒸馏水淋洗树脂，用80%乙醇以3 BV/h的速率洗脱，收集洗脱液每2 mL测1次多酚浓度，绘制动态洗脱曲线。

1.3.7抗氧化活性测定

1.3.7.1还原力的测定[12]

在2.5 mL pH值6.6磷酸盐缓冲液中加入不同浓度的试样溶液2.5 mL，1%铁氰化钾溶液2.5 mL，混合物在50 ℃恒温20 min后，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，然后以3 000 r/min离心分离10 min，取上清液5 mL加蒸馏水5 mL、0.1% FeCl3溶液1 mL，在700 nm处测定吸光度。以蒸馏水为无还原能力对照，维生素C、BHT作为还原能力对照。

1.3.7.2对超氧阴离子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）的清除作用[13]

取4.5 mLTris-HC1缓冲溶液，于25 ℃水浴中放置20 min，分别加入1 mL不同浓度的试验溶液和0.4 mL 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，然后加入 8 mmol/L 的HCl溶液1 mL终止反应，然后在420 nm处测定吸光度D1，空白以蒸馏水代替样品液，测定吸光度D0。按下式计算清除率：

[JZ] O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率=（D0-D1）/D0×100%。

1.3.7.3橄榄多酚提取物亚硝酸盐（NO2-）的清除作用[14-15]

取不同浓度的样品液3 mL于具塞试管中，用pH值3.0的柠檬酸缓冲液定溶至5 mL，然后每管中加入 5 μg/mL 亚硝酸钠1 mL，混匀，立即置于37 ℃水浴中保温 1 h，随后立即向各反应管加入0.4%的对氨基苯磺酸1 mL，混匀，静置5 min；再向各管加入0.2%的盐酸萘乙二胺显色剂0.5 mL，摇匀，定容至10 mL，静置15 min。每样品管同时做不加亚硝酸钠的本色管（空白管），并做亚硝酸钠的标准管（不加样品，其余相同），分别测各管在538 nm处的吸光度D值。按下式计算清除率：

[JZ]NaNO2清除率=[D标-（D样-D空）]/D标×100%。

式中：D标为不加待测样只加了NaNO2标准液和其他试剂的反应管光密度；

D样为既加待测样又加了NaNO2标准液和其他试剂的反应管光密度；

D空为只加待测样和其他试剂不加NaNO2标准液的的反应管光密度。

以上试验，每个试样做3次平行。

2结果与分析

2.1树脂的筛选

大孔吸附树脂的吸附实质为一种物体高度分散或表面分子受作用力不均等而产生的表面吸附现象，这种吸附性能是由于范德华引力或生成氢键的结果；同时由于大孔吸附树脂的多孔性结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用[16-17]，酚类化合物的分子中含有多个酚羟基，分子极性并不太高，因此在弱极性和非极性树脂上吸附的效果更好[18]。从图1可以看出，D101吸附率最低；HPD-200虽然吸附率最高，但解吸率却最低；HP-20吸附率第2，解吸率是倒数第2；XAD-7HP、XAD-16、AB-8的吸附率都较高，其中以 XAD-16最高，所以选XAD-16为最佳吸附树脂。

2.2最佳大孔树脂的静态吸附与解析曲线

可以看出，XAD-16树脂对油橄榄果渣多酚的静态吸附率随着吸附时间的延长而提高，1 h时的吸附率即可达到78.94%，表明XAD-16的吸附效率高。

可以看出，在0.5 h的解吸时间内，多酚解吸率迅速达到84.64%，超过2 h后，随着吸附时间的延长，解吸率变化趋于平缓，表明80%的乙醇溶液经过2 h就能把油橄榄果渣多酚很好地从大孔树脂XAD-16中解吸出来，解吸时间短，解吸率高，最高可达88.45%。

2.3吸附动态试验

2.3.1pH值对吸附的影响

pH值對物质吸附的影响主要取决于化合物的酸碱度，酸性化合物在酸性溶液中易被吸附，碱性化合物在碱性条件下易被吸附[19]。从图4可以看出，随着pH值的升高，XAD-16树脂对油橄榄果渣多酚的吸附率呈现先升高后下降的趋势，并在pH值为4时达到最大值。这可能与多酚类物质属于带羟基的多元酚酸类有关，在微酸性环境下，酚类物质的结构不易被破坏，以分子态存在，易于被识别并吸附[20]；在溶液pH值较高条件下，多酚化合物的酚羟基会解离形成H+，并产生相应的阴离子，进而削弱溶液中氢键间的相互作用力，最终导致树脂的吸附能力随之下降[14]。因此，样液的pH值调为4最佳。

[FK（W11][TPXBX4.tif][FK）]

2.3.2上样流速对吸附的影响

上样流速对树脂吸附的影响主要是溶质向树脂表面的扩散作用，对于相同浓度的上样溶液，上样流速过大，树脂的吸附率就会降低。上样流速过小，多酚分子虽然能够充分与树脂接触，但吸附时间太长，不适用于生产。从图5可以看出，上样流速越快，XAD-16树脂对油橄榄果渣多酚的吸附率逐渐降低，在上样流速为1 BV时，吸附率为98.29%；在上样流速为2 BV时，吸附率为 98.14%。既要使大孔吸附树脂的吸附效果好，又要保证较高的工作效率，综合考虑采用2 BV的上样流速较为适宜。

2.3.3上样浓度对吸附的影响

从图6可以看出，随着上样浓度的增加，吸附率随之升高；当浓度达到0.3 mg/mL时，吸附率达到最高值98.36%；超过0.3 mg/mL浓度后，吸附率稍有下降。根据吸附平衡理论，浓度减小，达到平衡时所需提液体积增大，残留在流出液中的多酚增多，吸附率降低；浓度过高时，树脂表面的多酚分子单分子层吸附饱和后，会发生多层吸附，并容易产生絮凝和沉淀，堵塞微孔，降低内孔利用率，吸附率也将下降[19，21]。因此，上样浓度控制在 0.3 mg/mL 为宜。

2.4解析动态试验

2.4.1乙醇浓度对洗脱效果的影响

从图7可以看出，在一

定范围内，随着乙醇浓度的增加，树脂对油橄榄果渣多酚的解吸率逐渐提高，当乙醇浓度为80%时，解吸率达到最大值 97.82%，继续提高乙醇的浓度，解吸率反而有所下降。因为乙醇浓度过低时，解吸液的极性较高，不仅不能破坏树脂与多酚间形成的氢键，而且多酚在解吸液中的溶解性低，解吸率也低；当乙醇浓度过高时，油橄榄果渣多酚提取液中的大分子物质沉淀会使树脂中多酚分子扩散困难，同时水溶性多酚的溶解量降低而导致解吸率降低。因而选用80%的乙醇溶液进行洗脱。

2.4.2洗脱剂的体积对洗脱效果的影响

洗脱剂乙醇体积对油橄榄果渣多酚洗脱效果的影响见图8。从图8可以看出，随着乙醇用量的增加，多酚的解吸率也随之增加，在洗脱体积为3 BV后效果增加不明显。综合考虑选择洗脱剂乙醇的用量为3 BV为宜。

2.4.3动态洗脱曲线的绘制

XAD-16树脂的动态洗脱曲线见。油橄榄果渣多酚洗脱峰相对集中，较容易洗脱。流出液体积达到4 mL时开始有多酚流出；随着流出液体积增加，洗脱液中多酚浓度快速上升，当流出液体积达到8 mL左右，多酚浓度达到最大值0.58 mg/mL；随后流出液体积再增加，多酚浓度降低。当洗脱液达30 mL时，洗脱基本完成，因此，选用3 BV的洗脱体积，可使洗脱液中的多酚含量达到最大。

2.5抗氧化活性测定

2.5.1还原力的测定

多数非酶类抗氧化剂是通过还原反应终止氧化链式反应的，所以，化合物的还原能力是显示其是否具有抗氧化潜能的重要因素[14]。由K3Fe（CN）6反应成K4Fe（CN）6，并进一步生成Fe4[Fe（CN）6]3，这是一有色反应的过程，在700 nm波长处有最大吸收峰，吸光度越大則样品的还原力越强[22]。油橄榄果渣多酚与维生素C、BHT还原力的比较见图10。从图10可以看出，在试验浓度范围内，试样的还原力随着浓度的增加均呈上升变化趋势；油橄榄果渣多酚的还原力低于维生素C，高于BHT，表明油橄榄果渣多酚具有较强的还原能力。

超氧阴离子自由基是生物体内氧代谢首先形成的自由基，是所有氧自由基的前身，在某些病理情况下，机体内 O-2[KG-*2]· [KG-*3]产生过多或清除能力减弱，使体内 O-2[KG-*2]· [KG-*3]浓度升高，就会产生氧化损伤而诱发多种疾病[23]，因此，在检验物质的抗氧化活性时常把清除超氧阴离子自由基作为重要指标之一。以维生素C、BHT为对照，测定油橄榄多酚对超氧阴离子自由基的清除率见图11。油橄榄果渣多酚对超氧阴离子自由基具有一定的清除作用，但其清除能力比维生素C、BHT的要弱。当浓度为0.1～0.3 mg/mL时，油橄榄果渣多酚对超氧阴离子自由基的清除率从5.17%迅速增至51.86%，随后随着样品浓度的继续增加而清除率变化幅度不大，在浓度为0.5 mg/mL时清除率达到最大值63.64%。

2.5.3油橄榄多酚提取物亚硝酸盐（NO2-）的清除作用

N-[CM（24*5]亚硝基化合物是一种具有强烈致癌作用的化合物，其前

提物质广泛存在于食品中以及产生于食物在体内的代谢中，硝酸盐或亚硝酸盐和胺类可在体内合成亚硝胺，尤其在胃液中更易合成[24]，是诱发胃癌的重要因素。以维生素C、BHT为对照，研究油橄榄多酚对亚硝酸盐的清除作用，试验结果见图12。在同样浓度条件下，油橄榄果渣多酚对于亚硝酸盐的清除能力低于维生素C、BHT。在试验浓度范围内，油橄榄果渣多酚对亚硝酸盐的清除作用随着试样浓度的增加而提高，清除率最大值为浓度在0.5 mg/mL时的52.27%。

3结论

通过对6种大孔树脂吸附分离性能的考察，筛选出最佳树脂为XAD-16。进一步对油橄榄果渣多酚的分离纯化工艺进行了优化：上柱条件为油橄榄果渣多酚提取液浓度 0.3 mg/mL，最佳pH值为4，上样流速为2 BV/h。解吸条件为洗脱剂乙醇体积分数80%，洗脱量为3 BV。采用大孔树脂分离油橄榄果渣多酚具有吸附容量大、选择性好、易于解吸、机械强度高、再生处理简单、操作简单、得率恒定、产品质量稳定、成本低等特点。

在试验浓度范围内，油橄榄果渣多酚具有良好的抗氧化能力，其还原力低于维生素C，高于BHT；油橄榄果渣多酚浓度在0.5 mg/mL时对超氧阴离子自由基、亚硝酸盐的清除率分别为63.64%、52.27%，表现出良好的清除效果。

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