木质纤维物质中纤维素和半纤维素含量的测定

张文博++贺建龙++蒋浩++熊鹏

摘要：以稻草秸秆为样品，通过美国国家可再生能源实验室（NREL）方法水解得到液体成分，采用苔黑酚比色法和蒽酮比色法测定其五碳糖（5C）和六碳糖（6C）的含量。结果表明，液体成分中5C和6C达到一定浓度比例时，会互相干扰测定的准确度。对已有测定纤维素、半纤维素含量的方法进行综合应用并加以改进，分析测定液体中5C和6C在不同波长下互不干扰的最大浓度和可测范围。结果发现，在620 nm波长下准确测定水解液中6C含量时，要同时满足[5C]<0.070 9 g/L和[5C]/[6C]<16；在660 nm波长下准确测定液体中5C含量时，要同时满足[6C]<0.023 3 g/L 和[6C]/[5C]<24。在可测范围内，可以通过稀释法达到测定要求，此法适用于混合液中5C和6C含量的测定，与高效液相色谱（HPLC）法进行对比，测定结果相对误差的绝对值小于统计学上规定的5%，表明该法适用于木质纤维物质中纤维素和半纤维素含量快速、准确的测定。

关键词：美国国家可再生能源实验室（NREL）；纤维素；半纤维素；稻草秸秆；定量分析

中图分类号： TK61文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）05-0281-03

木质纤维素的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，3种组分含量的多少及变化是木质纤维素原料综合利用的重要依据，因此，准确测定木质纤维素中纤维素、半纤维素及木质素的含量十分必要[1]。目前常用72%浓硫酸法[2]测定木质素含量，硫酸与重铬酸钾氧化法[3]、硝酸乙醇法[4]、差重法[5]等测定纤维素含量，碱液提取法[6]、2 mol/L盐酸水解法[7]等测定半纤维素含量，它们的主要缺点是操作复杂、耗时长且无法进行批量测样。其中用2 mol/L盐酸水解半纤维素时，难以控制水解程度，此法仅适用于对比性研究，应用领域受到局限[7]。美国国家可再生能源实验室（NREL）方法[8]是用72%浓硫酸和4%稀硫酸2步水解样品，得到滤液，然后用高效液相色谱（HPLC）法测定滤液中的单糖含量，虽然HPLC法测定结果较准确，但是单位时间所测样品有限，测定速度相对较慢，不适合批量测定。HPLC色谱柱一般采用的基质相对脆弱且价格昂贵，批量测样会很快损坏色谱柱。为了降低成本，方便、快速地测定木质纤维物质中纤维素和半纤维素的含量，以稻草秸秆为样品，先用NREL法处理样品得到滤液，然后分别用苔黑酚比色法[7]和蒽酮比色法[9]测定滤液中五碳糖（5C）和六碳糖（6C）的含量。在试验中发现，测定滤液中5C和6C含量时会出现相互干扰现象，从而影响了测定结果的准确性。因此本研究考察了滤液中5C和6C在不同波长下互不干扰测定结果的最大浓度和可测范围，并与HPLC法[8]的测定结果进行对比验证。

1材料与方法

1.1仪器、试剂与材料

9FZ-42型系列农作物秸秆粉碎机；UV752紫外-可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；XFH-50CA电热式压力蒸汽灭菌锅（浙江新丰医疗器械有限公司）；SHB-3循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；HH-4数显恒温水浴锅（金坛市鸿科仪器厂）；分析天平（上海越平科学仪器有限公司）。

72% H2SO4溶液[9]：665 mL浓H2SO4（汕头化工有限公司，分析纯）加入300 mL蒸馏水中，冷却至20 ℃，补加蒸馏水至1 000 mL。苔黑酚试剂[7]：A試剂，0.1 g FeCl3（天津市巴斯夫化工有限公司，分析纯）溶于100 mL 37%浓HCl（上海振企化学试剂有限公司，分析纯）中；B试剂，6 g苔黑酚（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）溶于100 mL无水乙醇（天津基准化学试剂有限公司）中，现用现配。蒽酮试剂[10]：0.2 g 蒽酮（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）溶于 100 mL 浓H2SO4（汕头化工有限公司，分析纯）中，现用现配。葡萄糖（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；D-木糖（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；所采用的其他试剂按常规法配制。稻草秸秆：产自江苏省淮安市，原料粉碎至1～2 cm，80 ℃烘干备用。

1.2测定方法

本试验拟定的系统定量分析程序是将NREL法与苔黑酚比色法和蒽酮比色法的综合应用并加以改进。以粉碎干燥后的稻草秸秆作为样品，用72%浓H2SO4和4%稀H2SO4 2步水解样品，样品中的纤维素、半纤维素被水解成单糖，然后分别采用苔黑酚比色法和蒽酮比色法进行定量，操作流程如图1所示[1，10]。

1.3不同波长下吸收曲线的绘制

[CM（24]用蒽酮定糖法测定葡萄糖和木糖在不同波长下的吸光

[FL（2K2]度：取3支洗净烘干的20 mL具塞刻度试管，其中1支为空白，配制0.05 g/L葡萄糖标准溶液和0.1 g/L木糖标准溶液，分别取1 mL标准溶液于另2支试管中，1 mL蒸馏水于空白试管中，再分别加入2 mL蒽酮试剂，混匀，100 ℃下煮沸 5 min，自来水冷却至室温，用10 mm玻璃比色皿，分别于 520～700 nm（波长间隔10 nm）波长下测定吸光度，绘制葡萄糖和木糖标准溶液在520～700 nm波长下的吸收曲线。

用苔黑酚比色定糖法测定葡萄糖和木糖在不同波长下的吸光度：取3支洗净烘干的20 mL具塞刻度试管，其中1支为空白，配制0.02 g/L木糖标准溶液和0.10 g/L葡萄糖标准溶液，分别取1 mL标准溶液于另2支试管中，1 mL蒸馏水于空白试管中，再分别加入2.000 mL A试剂和0.134 mL B试剂，混匀，100 ℃下煮沸20 min，自来水冷却至室温，用10 mm玻璃比色皿，于580～760 nm（波长间隔10 nm）波长下测定吸光度，绘制木糖和葡萄糖标准溶液在580～760 nm波长下的吸收曲线。

2结果与分析

2.1混合液中5C和6C之间相互干扰的分析

用本试验方法测定纯净单糖时，结果准确，但实际上所接触到的往往是某些糖的混合溶液，例如预处理稻草秸秆后得到的预处理液和固体水解液。用本试验方法处理稻草秸秆得到的滤液就是一种同时存在5C和6C的混合溶液。由图2和图3可知，不同浓度的葡萄糖和木糖标准溶液在同一波长下用同一种方法测定时，都会呈现不同的吸光度，也就是说当测定滤液中某一单糖的吸光度时，另一种单糖也会有吸光度。因为吸光度具有加和性，所以2种糖之间必然会存在某种程度的干扰。若滤液中一种单糖的浓度减小，那么所测吸光度也会相应减小，当该糖该浓度下的吸光度减小到可以忽略不计而又不影响另一种单糖正常测定时，便可以消除干扰。

2.2测定6C含量时，5C的最大干扰浓度和可测范围

配制不同浓度梯度的木糖标准溶液，用蒽酮比色法测定木糖的吸光度，采用5点法作图。因为6C与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区吸收峰为620 nm，所以以620 nm波长为中心，绘制580～650 nm波长下的木糖标准曲线。

选取所用紫外-可见分光光度计读数的最小可信值为 0.05，那么6C的吸光度≥0.05时，视为可信的吸光度，根据620 nm波长下葡萄糖的标准曲线（y=13.090x-0.006，r2=0999 9，y： 吸光度；x：浓度，g/L） 可以得到吸光度为0.05时

6C的浓度为0.004 3 g/L，此浓度即为6C的最小可测浓度。同理，5C的吸光度<0.05时，不会影响6C的吸光度，根据不同波长下木糖的标准曲线可以得到吸光度为0.05时5C的浓度，只有混合液中5C小于此浓度时，才不会干扰6C的测定结果，此时的5C浓度即为不干扰6C测定的最大浓度。因此，测定6C含量时，5C的浓度要小于最大干扰浓度，6C的浓度要大于最小可测浓度（0.004 3 g/L），即5C与6C浓度的比值会恒小于某个数。由5C和6C浓度的比值可以得到不同波长下的可测范围。

2.3测定5C含量时，6C的最大干扰浓度和可测范围

配制不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液，用苔黑酚比色法测定葡萄糖的吸光度，采用5点法作图。因为苔黑酚比色法测定木糖在660 nm波长下有最大吸光度，所以以 660 nm 波长为中心，绘制620～690 nm波长下的葡萄糖标准曲线。

选取所用紫外-可见分光光度计读数的最小可信值为 0.05，5C的吸光度≥0.05时，视为可信的吸光度，根据 660 nm 波长下木糖的标准曲线（y=62.870x-0.012，r2=0.999 9，y：吸光度；x：浓度，g/L）可以得到吸光度为0.05时5C的浓度为0.986 mg/L，此浓度即为5C的最小可测浓度。同理，6C的吸光度<0.05时，不会影响5C的吸光度，根据不同波长下葡萄糖的标准曲线可以得出吸光度为0.05时6C的浓度，只有混合液中的6C小于此浓度时，才不会干扰5C的测定结果，此时6C的浓度即为不干扰5C测定的最大浓度。因此，测定5C含量时，6C的浓度要小于最大干扰浓度，5C的浓度要大于最小可测浓度（0.986 mg/L），即6C与5C浓度的比值会恒小于某个数。由5C和6C浓度的比值可以得到不同波长下的可测范围（

3结论与讨论

本试验所采用的方法操作简便，成本低，测定结果准确，可以进行多个试样的分析，在具有一般化学分析条件的实验室内都可以使用。用本法准确测定混合液中6C含量时，需要同时满足[5C]<0.070 9 g/L和[5C]/[6C]<16；准确测定5C含量时，需要同时满足[6C]<0.023 3 g/L和 [6C]/[5C]<24。在测定混合液中5C和6C含量时，可以通过稀释的方法控制浓度大小，通过标准曲线计算得到的糖浓度符合表1和表2所列的互相不干扰范围，即认为测定结果准确。用本法测定稻草秸秆中纤维素含量38.74%、半纤维素含量21.84%，与HPLC法测定结果一致。此方法对测定木质纤维素原料中纤维素和半纤维素的含量提供了帮助，也为进一步利用木质纤维素这一宝贵的资源提供了资料。

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