转染BRMS1基因对人类胰腺癌细胞在裸鼠体内肿瘤转移能力影响的研究*

赵卫东 侯 燕 韩国新 王庆宝

(1. 泰山医学院附属东平医院普外科，山东 东平 271500；2. 东平县中医院体检中心，山东 东平 271500；3. 泰山医学院附属医院普外科，山东 泰安 271000)

转染BRMS1基因对人类胰腺癌细胞在裸鼠体内肿瘤转移能力影响的研究*

赵卫东1侯 燕2韩国新3王庆宝3

(1. 泰山医学院附属东平医院普外科，山东 东平 271500；2. 东平县中医院体检中心，山东 东平 271500；3. 泰山医学院附属医院普外科，山东 泰安 271000)

目的 建立人类胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，研究BRMS1基因对人类胰腺癌细胞在裸鼠体内肿瘤转移能力的影响，寻找胰腺癌基因治疗的有效模式。方法 利用脂质体转染技术将构建的pEGFP-C1-BRMS1重组载体、pEGFP-C1空载体稳定转染入人类胰腺癌细胞株PANC-1中，接种三组(转染组、空载体组、未转染组)细胞于裸鼠背部皮下，5周后处死裸鼠，取肿瘤、淋巴结及肺组织进行组织病理学检查。结果 将pEGFP-C1-BRMS1重组载体、pEGFP-C1空载体转染入人类胰腺癌细胞株PANC-1，并建立了人类胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，三组裸鼠肿瘤大小无明显差异，但转染组裸鼠淋巴结转移率明显低于空载体组和未转染组。结论 BRMS1基因不影响人类胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，但可以抑制人类胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤的局部淋巴转移。

BRMS1；肿瘤转移；胰腺癌；稳定转染；裸鼠皮下移植瘤模型

胰腺癌是一种恶性程度高、转移早、预后差的消化道恶性肿瘤，近年来其发病率在全球范围内呈上升趋势[1]，在所有肿瘤中其发病率位居第11位，但死亡率居第5 位，其死亡率与发病率之比为0.99∶1[2]。近年来，肿瘤转移基因[3]与肿瘤的关系日益引起人们的重视，通过抑制肿瘤转移来治疗肿瘤是可以考虑的，肿瘤转移抑制将成为我们治疗肿瘤的一个新途径[4]。BRMS1(breast-cancer metastasis suppressor 1, BRMS1)是Seraj等[5]在2000年新报道的一种转移抑制基因，该基因同其他转移抑制基因一样可以抑制肿瘤的远处转移，但不影响肿瘤在原位的生长[6]。我们将BRMS1通过脂质体介导稳定转染入BRMS1基因表达缺失的人类胰腺癌细胞PANC-1中，恢复胰腺癌细胞BRMS1基因的表达，观察BRMS1基因对裸鼠[7]体内肿瘤转移能力的影响，为胰腺癌的基因治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验用细胞、动物及质粒

人类胰腺癌细胞株PANC-1由泰山医学院肝胆胰研究所惠赠；BALB/C-NU裸鼠购自北京大学医学部实验动物科学部；pEGFP-C1空载体质粒由泰山医学院肝胆胰研究所惠赠；pEGFP-C1-BRMS1重组质粒由长沙赢润生物技术有限公司构建。

1.2 主要试剂

DMEM培养基购自Solarbio公司；新生牛血血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；脂质体LipofectamineTM2000、Opti-MEM、G418均购自Invitrogen公司。

1.3 方法

根据NCBI上序列号为NM_015399的BRMS1基因序列设计上游引物和下游引物(pEGFP-C1载体图谱和多克隆位点见图1)。为克隆至pEGFP-C1载体，上游引物引入BglⅡ酶切位点，下游引物引入EcoRⅠ酶切位点，且使其读码框与pEGFP-C1载体的读码框一致。BRMS1-f：5'-CCC AGATCT ATGCCTGTCCAGCCTCCAAGCAAAG-3'(下划线为BglⅡ酶切位点)BRMS1-r：5'-CG GAATTC TCAAGGTCCATCCGATTTTCTCTTCTGAGG-3'(下划线为EcoRⅠ酶切位点)。以pUC57-BRMS1为模板，扩增BRMS1基因片段，PCR产物的特异性条带用胶回收试剂盒进行回收，亚克隆至pEGFP-C1载体，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在GIS凝胶成像系统中检测750 bp的带，初步证明BRMS1片段克隆到pEGFP-C1载体(见图2)，同时将目的DNA片段BRMS1连入pEGFP-C1 载体的阳性菌种送南京金斯瑞公司测序(见图3)。PANC-1复苏、传代，观察14天内使细胞全部死亡的最低浓度600μg/ml为G418筛选浓度，采用脂质体法介导细胞pEGFP-C1-BRMS1重组质粒转染及pEGFP-C1空载体转染，24 h后用荧光显微镜观察pEGFP-C1-BRMS1重组质粒及pEGFP-C1空载体是否转染转染入细胞中(实验结果见图4)。以浓度为600μg/ml的G418筛选pEGFP-C1-BRMS1重组质粒转染细胞、pEGFP-C1质粒转染细胞，获得稳定转染细胞系的阳性克隆，随机挑取阳性克隆移至25 cm2培养瓶中培养并传代。细胞分组如下：A组为转染组，B组为空载体组，C组为为转染组。

免疫细胞化学(SP法)检测细胞BRMS1的表达，(实验结果见图5)。分别取A、B、C三组细胞，观察细胞汇合度达90%，台盼蓝染色观察细胞活力>90%，制备细胞悬液，调整细胞密度至1×107/ml，置于无菌EP管中备用。取36只4周龄雌性BALB/C-NU裸鼠随机分成3组，每组12只，分组如下：A组为转染组，B组为空载体组，C组为为转染组。将A、B、C三组细胞悬液分别接种于A、B、C三组裸鼠背部皮下，每只裸鼠接种0.2 ml(细胞密度为2×106/ml)，常规SPF级饲养裸鼠，每三天观察裸鼠皮下移植瘤的生长变化，测量裸鼠体重。继续饲养裸鼠至5周后，脱颈处死裸鼠，解剖裸鼠，取出皮下移植瘤、局部转移淋巴结、肺脏。分别测量A、B、C三组裸鼠皮下移植瘤，肿瘤相互垂直的两条径线分别记作x与y，MD为肿瘤平均直径，根据MD=(xy)1/2来计算肿瘤大小。分别计数A、B、C三组裸鼠的局部转移淋巴结个数。分别观察A、B、C三组裸鼠的肺脏转移情况。将皮下移植瘤、局部转移淋巴结、肺脏标本置于10%中性甲醛中固定，石蜡包埋切片，HE染色，免疫组织化学(SP法)检测裸鼠皮下移植瘤及局部转移淋巴结BRMS1的表达。

1.4 统计学处理

采用SPSS19.0版软件，进行单因素方差分析和四格表卡方检验，数据以均数±标准差来表示，P≤0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 BRMS1片段的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在GIS凝胶系统中检测，出现BRMS1片段的条带(约750 bp)，PCR扩增出的片段大小与BRMS1片段的理论大小一致，胶回收约750 bp大小的PCR片段。将BRMS1基因片段亚克隆至pEGFP-C1载体。pEGFP-C1-BRMS1阳性克隆经EcoRⅠ和BglⅡ酶切鉴定，切出约4.7 kb的载体带和约750 bp的片段，初步推测BRMS1已经克隆到pEGFP-C1载体(实验结果见图2)。阳性克隆测序结果表明，pEGFP-C1-BRMS1构建正确(实验结果见图3)。

2.2 采用脂质体法分别将pEGFP-C1-BRMS1重组质粒和pEGFP-C1空载体转染到PANC-1细胞中，在荧光显微镜下观察到pEGFP-C1-BRMS1和pEGFP-C1在PANC-1细胞中表达。以100 μg/ml为浓度梯度，在100 μg/ml～1000 μg/ml范围内将G418加入PANC-1细胞中，并筛选出稳定转染细胞系。免疫细胞化学(SP法)结果显示：转染了pEGFP-C1-BRMS1重组质粒的胰腺癌PANC-1细胞BRMS1呈阳性表达，胞内可见棕褐色颗粒，而转染了pEGFP-C1空载体与未转染的胰腺癌PANC-1细胞BRMS1则未见阳性表达。

2.3 细胞悬液接种于裸鼠背部皮下后7～10天开始出现皮下结节，色与周围皮肤相同，呈圆形，直径4～6 mm，局部隆起1～2 mm，质地韧，渐增大。至4～5周形成约11 mm×11 mm×11 mm大小瘤体，呈圆形、椭圆形，色粉红，边界清楚，表面光滑，包膜完整，活动度大。三组裸鼠成瘤时间、肿瘤生长速度、瘤体大小未见明显差异。5周后处死三组裸鼠大体解剖(肺脏未见明显转移结节)并取肿瘤、局部转移淋巴结及肺脏标本行组织病理学观察。

转染组(A)、空载体组(B)、未转染组(C)裸鼠皮下移植瘤直径均数分别为： 10.75±1.54 mm 、11.17±1.53 mm、11.67±1.37 mm，A、B、C三组数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)处理，F=1.149，P=0.329，P>0.05，说明A、B、C三组裸鼠皮下移植瘤大小比较无统计学意义。

转染组(A)、空载体组(B)、未转染组(C)裸鼠局部转移淋巴结比例分别为：33.33%±0.49%、83.33%±0.39%、91.67%±0.08%。 A、B、C三组数据采用四格表精确概率检验法(Fisher's exact test)处理(见表1～3)。转染组分别与空载体组、未转染组比较，P值分别为：0.036、0.009，P<0.05，说明差异有统计学意义。空载体组与未转染组比较，P值为1.000，P>0.05，说明差异无统计学意义。

图1 pEGFP-C1载体图谱和多克隆位点

1：pEGFP-C1-BRMS1 M：DNA Marker IV

图3 测序比对结果

图4 转染pEGFP-C1-BRMS1重组质粒后胞内表达(典型细胞)

图5 转染pEGFP-C1-BRMS1重组质粒的PANC-1细胞：

图6 转染组局部淋巴结免疫组化切片(40×)：BRMS1

有转移淋巴结无转移淋巴结P值转染组(A)空载体组(B)410820.036

表2 转染组与未转染组比较

表3 空载体组与未转染组比较

转染组、空载体组、未转染组裸鼠局部转移淋巴结性免疫组化结果显示：转染组局部转移淋巴结BRMS1呈阳性表达，胞内可见棕褐色颗粒(见图6)，而空载体组和未转染组局部转移淋巴结BRMS1呈阴性表达。

3 讨 论

BMRS1基因是Seraj等[8]于2000年新发现的肿瘤转移抑制基因，BMRS1基因全称为乳腺癌转移抑制基因1(breast-cancer metastasis suppressor l)，定位于染色体1lql3.1～q13.2，有10个外显子和9个内含子，cDNA全长为1485 bp，其中包含一个740 bp的开放读码框，分子量为28500。Smanat等[9]将BRMS1基因转染至乳腺癌细胞中，研究发现其转移潜能降低了70%～90%，但是对乳腺癌的生长并未见明显影响，然后将稳定转染了BRMS1基因的乳腺癌细胞接种至裸鼠乳腺脂肪垫下，发现肺部和局域淋巴结转移与对照组比较明显减少。尽管BRMS1基因是作为乳腺癌转移抑制基因而被首先发现的，但是后续的研究发现BRMS1基因在多种肿瘤转移中也起抑制作用。Seraj等[10]、Shevde等[11]和张殊等[12]相继研究发现在膀胱癌、黑色素瘤和卵巢上皮癌中BRMS1基因表达的缺失和降低可以造成肿瘤的远处转移。

本研究采用基因重组技术构建BRMS1基因的真核表达载体pEGFP-C1-BRMS1，根据NCBI上序列号为NM_015399的BRMS1基因序列设计上游引物和下游引物。然后选择具有高转移潜能的人类胰腺癌细胞PANC-1 作为靶细胞，采用脂质体法分别将pEGFP-C1-BRMS1重组质粒和pEGFP-C1空载体转染到PANC-1细胞中，在荧光显微镜下分别观察到pEGFP-C1-BRMS1和pEGFP-C1在PANC-1细胞中表达。我们将pEGFP-C1空载体转染到PANC-1细胞中设为阴性对照，是为了排除转染对细胞状态的影响，同时又设未转染的PANC-1细胞为空白对照以评定实验的准确度以及观察实验是否处于正常状态，然后又用免疫细胞化学检测细胞BRMS1的表达。

本研究选用BALB/C-NU裸鼠来作为实验动物，其主要特征表现为无毛(hair less)和无胸腺(athymus less)，仅有胸腺残迹或异常上皮，这种上皮不能使T细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能，因而细胞免疫力低下。其B淋巴细胞正常，但功能欠正常，免疫球蛋白主要是IgM，只含少量IgG。由于T淋巴细胞缺陷，不能执行正常T淋巴细胞功能，在混合淋巴细胞反应中全无有丝分裂反应，也不产生细胞毒效应细胞，对刀豆A或植物凝集素亦无有丝分裂应答，无接触敏感性，无移植排斥，成年裸鼠(6～8周龄)较普通鼠有较高水平的NK细胞活性，但幼年裸鼠(3～4周龄)的NK细胞活性低下。随着裸鼠年龄增长或有关因素的影响(如病毒感染)，裸鼠体内正常T细胞会增加，故本研究接种肿瘤采用4周龄小鼠。

本研究得出的数据显示：BRMS1基因转染组、空载体组、未转染组裸鼠皮下移植瘤直径均数分别为：10.75±1.54 mm、11.17±1.53 mm、11.67±1.37 mm，三组数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)处理，F=1.149，P=0.329，P>0.05，说明三组裸鼠皮下移植瘤大小比较无统计学意义，从以上数据可以得出，BRMS1基因不影响人类胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的形成和生长。另一组数据显示： BRMS1基因转染组、空载体组、未转染组裸鼠局域转移淋巴结比例分别为：33.33%±0.49%、83.33%±0.39%、91.67%±0.08%，三组数据采用四格表精确概率检验法(Fisher's exact test)处理，转染组分别与空载体组、未转染组比较，P值分别为：0.036、0.009，P<0.05，说明差异有统计学意义。从这一组数据可以得出，BRMS1基因对人类胰腺癌裸鼠皮下移植瘤局域淋巴结的转移有抑制作用。BRMS1基因作为肿瘤转移抑制基因有望于肿瘤的基因治疗[13]，将是一种非常有前景的的肿瘤转移抑制制剂，该基因的开发和利用定会给肿瘤的基因治疗开辟一条新的途径，具有重要的社会意义和经济价值。然而该研究领域目前还处于动物实验阶段，对肿瘤转移抑制的确切机制尚未阐明，我们将进一步通过更先进的实验手段深入研究BRMS1基因对人类胰腺癌转移的影响并进一步深入探讨其作用机制。

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Study on BRMS1 gene transfection of human pancreatic cancer cells in nude mice effects of tumor metastasis

ZHAO Wei-dong HOU Yan HAN Guo-xin WANG Qing-bao

(1.Dept. of general surgery, Affiliated Hospital of Taishan Medical University of Dongping branch， Dongping 271500,China;2.Medical examination center, Dongping County Hospital of traditional Chinese， Dongping 271500,China;3.Dept. of general surgery, Affiliated Hospital of Taishan Medical University， Taian 271000,China)

Objective: The establishment of human pancreatic cancer nude mice model to study the BRMS1 gene in human pancreatic cancer cells in nude mice tumor metastasis ability to find an effective model of pancreatic cancer gene therapy.Methods: Liposome transfection technique using the constructed pEGFP-C1-BRMS1 recombinant vector, pEGFP-C1 empty vector stably transfected into human pancreatic cancer cell line PANC-1, the inoculated three groups (transfected group, empty vector group, not transfected group) cells subcutaneously in nude mice, mice were killed after 5 weeks, the tumor, lymph node and lung tissue for histopathological examination.Results: The pEGFP-C1-BRMS1 recombinant vector, pEGFP-C1 empty vector transfected into human pancreatic cancer cell line PANC-1, and established human pancreatic cancer xenograft model in nude mice, three groups no significant difference in tumor size in nude mice However, lymph node metastasis in nude mice transfected group was significantly lower than the empty vector group and untransfected group.Conclusion: BRMS1 gene in human pancreatic cancer cells without affecting tumor growth in nude mice subcutaneously, but can inhibit human pancreatic cancer cells transplanted into nude mice of the local lymph node metastasis.

metastasis; pancreatic cancer; stable transfection; nude mice subcutaneous xenograft model

泰安市科技局立项项目(项目编号：20083042)。

赵卫东(1974—)，山东泰安人，主治医师，硕士研究生，主要从事临床肝胆胰肿瘤工作。

王庆宝，教授，山东省泰安人，泰山医学院附属医院普外科，泰山医学院肝胆胰研究所。Email：qbwang@tsmc.edu.cn。

R735

A

1004-7115(2017)02-138-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.02.006

2016-10-13)