酵母双杂交方法对牛CMYA1中Xin Repeat结构域的鉴定

2017-04-24 03:21王婷岳英伟杨淑萍靳聪飞辛向博张晓娟郭宏
天津农学院学报 2017年1期
关键词:双杂交诱饵酵母菌

王婷,岳英伟,杨淑萍,靳聪飞,辛向博,张晓娟,郭宏



酵母双杂交方法对牛CMYA1中Xin Repeat结构域的鉴定

王婷,岳英伟,杨淑萍,靳聪飞,辛向博,张晓娟,郭宏通信作者

(天津农学院动物科学与动物医学学院,天津300384)

CMYA1是肌肉生长发育相关基因,其表达产物包含若干个由16个氨基酸构成的重复序列,该重复序列被命名为Xin Repeat。为确定CMYA1的蛋白结合核心结构域,本研究利用酵母双杂交方法,以牛CMYA1基因的表达产物中含有Xin Repeat的区域作为预测结构域,通过对该区域的不同区段进行克隆建立酵母诱饵表达载体,并转化酵母菌,再与CMYA1的互作蛋白EIF3G和RPL35A进行酵母双杂交。结果表明,共获得了6个不同区段的CMYA1片段,并确定了4个Xin Repeat序列是蛋白结合结构域的最小功能单位。本研究结果有助于揭示CMYA1结构及Xin Repeat的功能,为进一步研究牛肌肉生长发育的分子机制提供理论依据。

CMYA1;Xin Repeat;结构域;酵母双杂交

CMYA1(Cardiomyopathy associated 1,原发性心肌症相关蛋白1)基因最早发现于鸡胚心肌细胞中,由此也被命名为Xin基因[1]。对CMYA1在转录水平和蛋白水平的组织表达特性研究发现,CMYA1基因从胚胎发育时期至成年期始终特异性表达于心肌及骨骼肌[2-5]。CMYA1蛋白序列中含有一个DNA结合结构域、一个核定位序列、一个脯氨酸富含区(SH3结构域)和若干个由16个氨基酸组成的被命名为Xin Repeat的保守序列单元[6]。Xin Repeat在蛋白结合及定位等方面发挥重要作用,是CMYA1中一段重要的结构域。Xin Repeat保守序列为GDV(K/Q/R/S)XX(R/K/T)WLFET(Q/R/K/T)PLD。通过对Xin Repeat序列在不同物种数据库中的检索发现,所有的脊椎动物(包括哺乳动物、禽类、两栖类、鱼类)中均出现Xin Repeat序列,而无脊椎动物中没有Xin Repeat序列[4],且不同物种有不同数目的Xin Repeat,如鸡Xin基因(cXin)编码的蛋白有26个Xin Repeat,小鼠的同源基因CMYA1和CMYA3编码的蛋白分别有15个和28个Xin Repeat,牛CMYA1共有6个Xin Repeat。Xin Repeat是一些蛋白的结合结构域,免疫共沉淀和酵母双杂交结果显示,小鼠CMYA1蛋白的最后4个Xin Repeat是β-连环蛋白的结合结构域,直接与β-连环蛋白的533~746氨基酸位点结合[7-8]。通过对小鼠Xin Repeat区进行不同分段克隆并通过免疫共沉淀试验发现,3个Xin Repeat是肌动蛋白微丝的结合结构域[4]。研究结果表明,Xin Repeat具有结合蛋白的能力,且不同数目的Xin Repeat结合蛋白的能力不同。在之前的研究中,发现牛CMYA1可以通过其Xin Repeat区域与某些蛋白结合,并通过酵母双杂交互作确定了核糖体蛋白RPL35A和真核翻译起始因子3的一个亚基EIF3G分别是CMYA1的结合蛋白。本试验以牛CMYA1蛋白的Xin Repeat为预测结构域,通过对牛Xin Repeat区进行分段,并分别与已知的2个互作蛋白RPL35A和EIF3G进行酵母双杂交结合试验,确定Xin Repeat的核心结构域,本研究可为揭示CMYA1蛋白的结构及Xin Repeat的功能提供分子理论依据。

1 材料

1.1 质粒和菌株

质粒pGBKT7、pGBKT7-53、pGADT7-T、pGADT7-Lam、酵母菌株Y2H Gold均购于Clontech公司,质粒pGADT7-RPL35A和pGADT7-EIF3G由本实验室构建并均已转化菌株Y187。

1.2 主要试剂

Es-Mix、DNA胶回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒等购自康为世纪公司,T4连接酶、限制性内切酶RIHI购于Fermentas公司,卡那霉素、各种氨基酸、酵母基本氮源、MarkerⅠ、MarkerⅢ购于索莱宝公司。

2 方法

2.1 酵母表达载体构建

2.1.1 牛CMYA1分段及引物设计

通过NCBI对CMYA1及Xin Repeat区进行了序列分析,按照Xin Repeat的数量和分布及CMYA1阅读框规则进行分段,具体分段方法见图1。

图1 牛CMYA1基因Xin Repeat分布及分段示意图

(注:CMYA1蛋白全长为1 820 aa,XINRP1片段包含第一至第四Xin Repeat,XINRP2片段包含第三至第六Xin Repeat,XINRP3片段包含第一至第三Xin Repeat,XINRP4片段包含第四至第六Xin Repeat,XINRP5片段包含第一和第二Xin Repeat,XINRP6片段包含第五和第六Xin Repeat)

利用NCBI中的Primer-BLAST分别对6条CMYA1的Xin Repeat区片段进行设计引物,分别在上游引物5’端插入EcoRI酶切位点,在下游引物5’端插入BamHI酶切位点。引物序列见表1。

表1 Xin Repeat分段引物序列

2.1.2目的片段扩增

首先提取牛肌肉组织RNA,反转录为cDNA作为模板,分别向扩增体系中加入10 μL Es-Mix、0.5 μL上游引物(10 μmol/L)、0.5 μL下游引物(10 μmol/L)、1 μL cDNA(100 ng)和8 μL去离子水,使PCR扩增总体系达20 μL。

PCR反应程序:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循环30次,72 ℃终延伸10 min。最终对PCR产物以1%琼脂糖进行凝胶电泳检测,并对PCR产物进行回收,胶回收操作步骤按照康维世纪DNA胶回收试剂盒说明书进行。

2.1.3 酶切、连接及转化大肠杆菌

用限制性内切酶RI和HI对各条目的片段进行双酶切,同时对载体pGBKT7进行双酶切,反应体系和条件参照Fermentas限制性内切酶说明书。连接各片段和载体,连接液转化DH5α大肠杆菌感受态,在含有卡那霉素的LB平板上进行培养,对阳性克隆进行测序,并对测序结果进行序列比对,本试验所有测序由苏州金唯智公司提供。

2.2 重组质粒转化酵母菌

2.2.1 酵母菌感受态的制备

用醋酸锂方法对酵母菌株Y2H Gold进行感受态细胞的制备。将冻存的酵母菌株Y2H Gold在YPDA平板上划线培养3 d,挑取生长最快的单菌落于3 mLYPDA液体培养基中扩增培养8~12 h,取5 μL菌液于50 mL的YPDA中扩增培养16~20 h,使600达到0.15~0.30,600为0.30时,菌数约为108/mL。700 g离心5 min,弃上清,用100 mL新鲜YPDA重悬,继续摇菌培养3~5 h,使600达到0.40~0.50,不要过度培养。将菌液移至两个50 mL无菌离心管中,700 g离心5 min,弃上清,用30 mL无菌水重悬。500 g离心5 min,弃上清,用1.5 mL 1.1×TE/LiAc重悬,即为感受态细胞。

2.2.2 转化酵母菌

将构建好的诱饵载体分别转化到酵母菌株Y2H Gold感受态细胞中。向预冷的无菌管中加入混合体系:重组质粒100 ng、carrierDNA(需变性处理)1 μL、50 μL感受态细胞、500 μL PEG/ LiAc并温和混匀。30 ℃孵育30 min,每隔5 min摇一次离心管,再加入20 μL DMSO,42 ℃孵育15 min,每隔5 min摇一次离心管。高速离心15 s,弃上清,用YPD+重悬。50 r/min,30 ℃孵育30 min。高速离心15 s,弃上清,用1 mL 0.9%(/)NaCl溶液重悬。分别取100 μL涂布于SD/-Trp固体培养基,30 ℃培养箱中倒置培养3~4 d,直至单克隆长出。

2.3 自激活与毒性测试

将6组转化的酵母菌分别进行自激活与毒性测试,各取100 μL诱饵菌于培养基SD/-Trp和SD/-Trp/X中。同时建立对照组,将pGBKT7-53和pGADT7-T共转化于酵母菌中,并在QDO/X/A平板中生长且菌落成蓝即为阳性对照,将转化pGBKT7质粒并在SD/-Trp和SD/-Trp/X中培养的酶母菌作为正常对照。培养3~4 d后,如果试验组与正常对照组的生长情况一致,则未发生自激活和没有毒性,说明构建的诱饵载体可以进行下一步互作试验。

2.4 酵母双杂交互作

将6组重组诱饵菌株分别进行活化,具体操作方法是:首先在平板上挑取一个新鲜的大小约为2~3 mm的单克隆溶于50 mL SD/-Trp液体培养基中。250 r/min,30 ℃培养16~20 h,直到600达到0.8。换培养基,1 000 g离心5 min,弃上清。然后用4~5 mL培养基SD/-Trp重悬细胞,使细胞浓度大于108/mL。室温融化转化捕获菌pGADT7-EIF3G和pGADT7-RPL35A,将100 μL捕获菌和100~200 μL诱饵菌混合,加入10 mL 2×YPDA液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)于50 mL离心管中,30 r/min,30 ℃培养20~24 h。20 h后,用400倍显微镜镜检菌液,如观察到2~3个酵母细胞结合成“Mickey Face”形状,说明菌体融合成二倍体,如果没有融合至二倍体状态则继续培养2~4 h,直至二倍体形成。换培养基,1 000 g 10 min离心,弃上清,同时用2 mL 0.5×YPDA对烧瓶进行清洗,继续收集残留在烧瓶中的细胞。1 000 g 10 min离心,弃上清。用1 mL0.5×YPDA/kana液体培养基重悬细胞。取部分菌液进行互作效率验证:对菌体进行梯度稀释,分别取1/10,1/100,1/1 000,1/10 000稀释倍数下的100 μL菌液分别涂布缺陷型培养基SD/-Trp、SD/-Trp/X和QDO/X/A中,30 ℃培养3~5 d,直到单克隆长出。同时建立对照组,以转化pGBKT7-53的Y2H Gold菌株和转化pGADT7-T的菌株Y187的杂交互作结合作为阳性对照,阳性对照应该在QDO/X/A培养基中长出蓝色菌落。

3 结果

3.1 牛CMYA1分段扩增结果

PCR扩增获得Xin Repeat片段,共6个片段,条带大小分别为XINRP1,1 023 bp;XINRP2,696 bp;XINRP3,618 bp;XINRP4,291 bp;XINRP5,396 bp;XINRP6,177 bp(图2)。条带大小与预期一致。

图2 PCR扩增电泳图

(注:泳道1为XINRP1,长度为1 023 bp;泳道2为XINRP2,长度为696 bp;泳道3为XINRP3,长度为618 bp;泳道4为XINRP5,长度为396 bp;泳道5为XINRP4,长度为291 bp;泳道6为XINRP6,长度为177 bp)

3.2 牛Xin Repeat区的载体构建测序结果

将6条片段XINRP1至XINRP6分别构建到pGBKT7酵母表达载体中,转化感受态大肠杆菌,对阳性克隆进行测序,测序峰图见图3。利用NCBI对测序结果与CMYA1序列进行比对,序列全部正确。

图3 XINRP1-6测序结果

(注:A. XINRP1的部分测序结果的峰图及序列。B. XINRP2的部分测序结果的峰图及序列。C. XINRP3的部分测序结果的峰图及序列。D. XINRP4的部分测序结果的峰图及序列。E. XINRP5的部分测序结果的峰图及序列。F. XINRP6的部分测序结果的峰图及序列)

3.3 重组载体转化及验证结果

将构建好的重组载体pGADT7-XINRP1至XINRP6分别转化到酵母菌感受态中,同时建立阳性对照,即共转化质粒pGBKT7-53和pGADT7-T,并在SD/-Trp/X培养基中生长,另外以转化质粒pGBKT7的酵母菌在培养基SD/-Trp和SD/-Trp/X为正常对照,观察试验组和正常对照组的生长情况。研究结果见图4,由图4可以看出,转化试验组即转化pGADT7-XINRP1的诱饵菌在SD/-Trp和SD/-Trp/X培养基中生长的菌落数量大小与正常对照组无明显差别,说明转化质粒没有毒性,试验组在培养基QDO/A/X中不出现菌落生长,而阳性对照组长出蓝色菌落,说明重组质粒未发生自激活,说明诱饵菌可以用于酵母双杂交试验。

(注:A. 转化pGBKT7-XINRP1至Y2H Gold菌株并在培养基SD/-Trp中生长。B. 转化pGBKT7-XINRP1至Y2H Gold菌株并在培养基SD/-Trp/X中生长。C. 转化pGBKT7-XINRP1至Y2H Gold菌株并在培养基QDO/A/X中生长。D. 转化pGBKT7至Y2H Gold菌株并在培养基SD/-Trp中生长。E. 转化pGBKT7至Y2H Gold菌株并在培养基SD/-Trp/X中生长。F. 共转化pGBKT7-53和pGADT7-T至Y2H Gold菌株并在培养基QDO/A/X中生长)

3.4 酵母双杂交互作结果

分别以转化pGBKT7-XINRP1至pGBKT7- XINRP6到酵母菌Y2H Gold中作为诱饵菌,分别与2个已知的CMYA1互作蛋白RPL35A和EIF3G进行一对一互作结合。通过缺陷型培养基SD/-Trp/-Leu筛选,结果表明,XINRP1和XINRP2对2个靶蛋白具有结合作用,如图5和图6所示。将第一次互作产生的阳性克隆分别转移至培养基QDO/X/A中,菌体呈蓝色,进一步说明XINRP1、XINRP2和RPL35A、EIF3G之间存在阳性结合(图7)。XINRP1和XINRP2分别含有4个Xin Repeat,结果说明4个Xin Repeat是结合RPL35A和EIF3G的核心结构域,3个及3个以下Xin Repeat不具有结合能力。

图5 转化pGBKT7-XINRP1至pGBKT7-XINRP6的6个诱饵菌与pGADT7-RPL35A的互作结果

(注:A. 诱饵菌pGBKT7-XINRP1与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合,有菌落长出。B. 诱饵菌pGBKT7-XINRP2与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合,有菌落长出。C. 诱饵菌pGBKT7-XINRP3与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合,无菌落长出。D. pGBKT7-XINRP4与pGADT7-RPL35A杂交结合,无菌落长出。E. pGBKT7-XINRP5与pGADT7-RPL35A杂交结合,无菌落长出。F. pGBKT7-XINRP6与pGADT7-RPL35A杂交结合,无菌落长出)

图6 转化pGBKT7-XINRP1至pGBKT7-XINRP6的6个诱饵菌与pGADT7-EIF3G的互作结果

(A. 诱饵菌pGBKT7-XINRP1与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合,有菌落长出。B. 诱饵菌pGBKT7-XINRP2与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合,有菌落长出。C. 诱饵菌pGBKT7-XINRP3与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合,无菌落长出。D. 诱饵菌pGBKT7-XINRP4与pGADT7-EIF3G杂交结合,无菌落长出。E. pGBKT7-XINRP5与pGADT7-EIF3G杂交结合,无菌落长出。F. pGBKT7-XINRP6与pGADT7-EIF3G杂交结合,无菌落长出)

图7 对互作的阳性克隆在QDO/A/X培养基中的培养结果

(A. 诱饵菌pGBKT7-XINRP1与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合的阳性克隆。B. 诱饵菌pGBKT7-XINRP2与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合的阳性克隆。C. 诱饵菌pGBKT7-XINRP1与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合的阳性克隆。D. 诱饵菌pGBKT7-XINRP2与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合的阳性克隆)

4 讨论

Xin Repeat是CMYA1蛋白中具有高度保守性的结构域,可以单独与一些蛋白发生互作,通过原位杂交等试验发现,富含Xin Repeat的基因高表达于肌卫星细胞及骨骼肌纤维中,Xin Repeat具有参与肌原纤维组装及维持肌纤维结构的作用,在对心肌发育及骨骼肌的分化形成方面起了重要作用[8-9]。在CMYA1与蛋白发生结合的过程中,Xin Repeat起到诸如亚细胞定位和提供蛋白结合位点等重要作用,Xin Repeat的个数在不同物种间的数量不同,其数量与功能有密切关系[6-8],小鼠CMYA1的Xin Repeat可以直接结合肌动蛋白,并发现3个Xin Repeat是结合肌动蛋白的最小结合单位[4]。

牛CMYA1基因的功能和结构及Xin Repeat作为结构域的蛋白互作分子机制尚未研究清楚。前期研究中对牛CMYA1蛋白中的Xin Repeat进行序列比对分析,在牛CMYA1蛋白中共找到6个Xin Repeat的保守序列,本研究中按照数量不同对这段结构域进行分段,一共获得了6个不同的CMYA1片段,并成功构建了酵母双杂交系统的诱饵融合载体,通过对诱饵载体的自激活和毒性测试检测表明,所有CMYA1基因片段的表达对酵母不产生毒性且不发生自激活现象,可以用于酵母互作鉴定。本次试验选择2个已知与CMYA1的Xin Repeat区互作的蛋白EIF3G和RPL35A作为酵母互作试验的捕获蛋白。RPL35A基因的表达产物为核糖体蛋白,大多核糖体蛋白参与组成核糖体,但也有报道表明,一些核糖体蛋白有除构成核糖体以外的其他独立功能,如与蛋白结合的功能等[10]。EIF3G是真核转录起始因子,是调控肌肉发育和蛋白合成的关键因子[11-12],EIF3基因是参与肌纤维蛋白合成的重要基因[13]。根据本试验中的结果表明,4个以上的Xin Repeat对RPL35A和EIF3G有结合能力,而4个以下Xin Repeat对RPL35A和EIF3G没有结合能力。由此说明,Xin Repeat是有独立功能的结构单元,且4个Xin Repeat是CMYA1与互作蛋白结合的最小结合单位。本研究结果对于揭示CMYA1中Xin Repeat的结构和功能提供了一定参考,可为CMYA1的研究和应用提供必要的理论依据。

[1] Wang D Z,Hu X,Lin J L,et al. Differential display of mRNAs from the atrioventricular region of developing chicken hearts at stages 15 and 21[J].,1996,1:a1-15.

[2] Wang D Z,Reiter R S,Lin J L,et al. Requirement of a novel gene,,in cardiac morphogenesis[J].,1999,126(6):1281-1294.

[3] Sinn H W,Balsamo J,Lillien J,et al. Localization of the novel in protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development[J].,2002,225(1):1-13.

[4] Pacholsky D,Vakeel P,Himmel M,et al. Xin Repeats define a novel actin-binding motif[J].,2004,117(11):5257-5268.

[5] Eulitz S,Sauer F,Pelissier M C,et al. Identification of XIN-repeat proteins as novel ligands of the SH3 domains of nebulin and nebulette and analysis of their interaction during myofibril formation and remodeling[J].,2013,24(20):3215-3226.

[6] Lin J J C,Gustafson-Wagner E A,Sinn H W,et al. Structure,ex-pression,and function of a novel intercalated disc protein,XIN[J].,2005,25(5):215-222.

[7] Choi S,Gustafson W E A,Wang Q,et al. The intercalated disc protein,mXINa,is capable of interacting with b-catenin and bundling actin filaments[J].,2007,282(49):36024-36036.

[8] Hawke T J,Atkinson D J,Kanatous S B,et al. XIN,an actin binding protein,is expressed within muscle satellite cells and newly regenerated skeletal muscle fibers[J].,2007,293(5):1636-1644.

[9] Molt S,Buhrdel J B,Yakovlev S,et al. Aciculin interacts with filamin C and XIN and is essential for myofibril assembly,remodeling and maintenance[J].,2014,127(16):3578-3592.

[10] Traub P,Bauer C,Hartig R,et al. Colocalization of single ribosomes with intermediate filaments in puromycin- treated and serum-starved mouse embryo fibroblasts[J].,1998,90(4):319-337.

[11] Jaqaman K,Grinstein S. Regulation from within:the cytoskeleton in transmembrane signaling[J].,2012,22(10):515-526.

[12] Hershey J W,Asano K,Naranda T,et al. Conservation and diversity in the structure of translation initiation factor EIF3 from humans and yeast[J].,1996,78(11-12):903-907.

[13] Loughlin L O,Lehr L,Havaranis A,et al. Encapsulation of “Core”eIF3,Regulatory components of elF3 and mRNA into liposomes,and their subsequent uptake into myogenic cells in culture[J].,1981,90(1):160-168.

责任编辑:张爱婷

Identification of Xin Repeat Domain of CMYA1 in Bovine by Yeast Two-Hybrid

WANG Ting, YUE Ying-wei, YANG Shu-ping, JIN Cong-fei, XIN Xiang-bo, ZHANG Xiao-juan, GUO HongCorresponding Author

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

CMYA1 is a muscle development related gene which expression product contains a number of repeat sequences composed of 16 amino acids, named Xin Repeat. To determine the CMYA1 domain of protein interaction, this study used Xin Repeats as a predicted domain of CMYA1. According to different number of Xin Repeats, we divided CMYA1 into different fragments and cloned into expression vectors and transformed into Yeast strain.As result, we obtained 6 fragments of CMYA1 fusion vectors for Yeast two-Hybrid as baits. The minimal unit of protein interacted domain was four Xin Repeats. This study revealed the structure of CMYA1 and the function of Xin Repeats, and provided a theoretical basis of molecular mechanism on bovine muscle growth and development.

CMYA1; Xin Repeat; domain; Yeast two-Hybrid

1008-5394(2017)01-0028-06

S813.1

A

2016-05-05

天津市自然科学基金项目“牛CMYA家族基因结构与功能研究”(11JCZDJC17600)

王婷(1985-),女,天津市人,硕士在读,研究方向为临床兽医学。E-mail:wangtingdbnd@126.com。

郭宏(1964-),男,内蒙古通辽人,教授,博士,研究方向为分子遗传与育种。E-mail:guohong64@163.com。

猜你喜欢
双杂交诱饵酵母菌
险恶之人
酵母双杂交技术筛选与绵羊微管解聚蛋白相互作用的蛋白
雪花诱饵
米卡芬净对光滑假丝酵母菌在巨噬细胞内活性的影响
受青枯菌诱导的花生根酵母双杂交文库构建和AhRRS5互作蛋白的筛选
为什么酵母菌既能做面包也能酿酒?
酵母双杂交技术研究进展
酵母菌及其衍生物在水产养殖中的研究与应用
郫县豆瓣中一株耐盐酵母菌的分离鉴定及其发酵性能
一种基于Radon-Wigner变换的拖曳式诱饵辨识方法