铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp450s的 影响

任 红，刘 冬，郑少杰，严弋敬，孙海燕,*，明 建,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.深圳职业技术学院 深圳市发酵精制检测系统重点实验室，广东 深圳 518055）

铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp450s的 影响

任 红1,2，刘 冬2，郑少杰1，严弋敬2，孙海燕2,*，明 建1,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.深圳职业技术学院 深圳市发酵精制检测系统重点实验室，广东 深圳 518055）

为探究铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp450s的影响，采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应法和Western blot法评价铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37 3 种酶的mRNA和蛋白表达。结果显示，与空白对照组相比，低剂量铁观音多酚提取物（150 mg/（kg·d））能显著诱导Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37的mRNA表达（P＜0.05），同时显著诱导Cyp2d22蛋白的表达，但对Cyp3a11蛋白表达无明显作用，对Cyp2c37蛋白表达呈现显著抑制作用；中剂量（300 mg/（kg·d））能显著抑制Cyp3a11、Cyp2c37的mRNA和蛋白表达（P＜0.05），而对Cyp2d22的mRNA和蛋白表达无显著影响；高剂量（600 mg/（kg·d））对3 种酶的mRNA表达无显著影响，但对3 种酶的蛋白表达呈显著抑制作用（P＜0.05）。结果表明铁观音多酚提取物能够影响小鼠肝Cyp3a11、Cyp2d22和Cyp2c37的表达，揭示了铁观音多酚提取物与药物合用时产生的代谢性药物相互作用。

铁观音茶；多酚提取物；Cyp450；mRNA；蛋白表达

茶叶在我国有数千年的栽种和饮用历史，现已作为世界公认的保健型饮料。茶叶的保健作用主要来源于其所含的主要生物活性物质——茶多酚[1]。茶多酚占茶叶干质量的15%～30%，主要由儿茶素、黄酮类、酚酸类、花色素四大类物质组成[2-3]。茶叶按照发酵度与制法，分为六大类，即绿茶、黄茶、白茶、乌龙茶、红茶和黑茶，其中乌龙茶属半发酵茶，福建安溪铁观音是乌龙茶中最著名的品种之一[4-5]。

茶多酚主要在肝脏中由肝细胞内滑面内质网上的肝药酶进行代谢，肝药酶又称细胞色素P450酶（CYP450s），是参与多种内源性及外源性物质在体内转化的混合功能氧化酶系统，其中涉及体内大多数药物代谢的主要3 个基因家族为CYP1、CYP2、CYP3，最主要的蛋白亚型有CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9等，大约占CYP450s氧化酶含量的30%、2%和20%，分别介导了临床药物约50%、30%、10%的代谢过程[6-8]。小鼠和人的药物代谢酶的基因具有同源性，即小鼠肝Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37分别相当于人肝CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9的表达[9-10]。

国内外大量研究表明，茶多酚作为一种生物活性物质，具有很强的抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、降血脂、降血糖、预防和治疗心脑血管疾病等多种生理生化作用[11]，饮茶也成为许多人必不可少的生活习惯。有关摄入茶多酚对肝CYP450s的影响至今鲜见报道，已有的少量研究报道结论各不相同，且主要针对茶多酚对其他外源物质代谢的影响或体外研究[12-13]，很多制备茶多酚的茶叶原料及制备过程并不明确[14]。为此，本研究采用铁观音绿茶多酚提取物在短期内对正常小鼠灌胃处理，采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR）法和Western blot法，从基因转录水平和宏观蛋白表达水平观察其对小鼠肝Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37的影响作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物、材料与试剂

铁观音购于福建安溪，属二级茶叶，烘干、打粉，过80 目筛，避光常温保存。

实验动物（C57BL/6小鼠，雌性SPF级，7～8 周龄，体质量（18±2） g）和饲料均购自南方医科大学实验动物中心。

UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、1×TE buffer、Cyp3a11、Cyp2c37、Cyp2d22引物、Loading buffer 生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR®Premix Ex Taq™（TliRNaseH Plus）、RNase-free水 宝生物工程（大连）有限公司；BCA蛋白定量试剂盒 美国Pierce公司；Cyp3a11、Cyp2c37、Cyp2d22一抗（多克隆兔抗）、二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔） 艾博抗（上海）贸易有限公司；脱脂奶粉 美国CST公司；NP-40 美国Merck公司；100×蛋白酶抑制剂 美国Sigma公司；ECL化学发光液、预染蛋白Maker 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；甲醇、氯仿、无水乙醇均为国产试剂。

1.2 仪器与设备

5180 R型冷冻离心机、22331 Hamburg紫外分光光度计、微量移液枪、普通PCR仪 德国Eppendorf公司；FastPrep-24样品处理系统 安倍医疗器械贸易（上海）有限公司；LightCycler 1.5荧光定量PCR仪 瑞士Roche公司；MiniProtein电泳系统、Mini Trans-Blot转膜系统、全自动凝胶成像仪 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Spectra Max M5e多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；Laborota4001型旋转蒸发仪德国Hedolphg公司；MS1 Minishaker漩涡混合仪 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 铁观音多酚的提取

参照GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》并稍做修改[15]。取20 g已处理的铁观音茶粉，按1∶25（m/V）加入预热的70%甲醇，装入1 000 mL的圆底烧瓶中并用玻璃棒充分搅拌均匀润湿，立即转入70 ℃水浴中，装上冷凝管，回流冷浸提30 min。浸提后冷却至室温，过滤，将滤渣重新加入圆底烧瓶，重复浸提3 次。合并滤液，将滤液旋转蒸发至原体积的15%～20%，保证甲醇几乎被旋蒸完全，再用3 倍体积氯仿萃取1 次，再次旋转蒸发，将其旋转蒸发至萃取后体积的5%左右，溶解剩余部分于超纯水中。10 000 r/min离心15 min，取上清液，真空冷冻干燥，常温避光保存。

1.3.2 实验动物及处理

将24 只健康成年SPF级C57BL/6小鼠随机分为4 组，即空白对照组（control），铁观音茶多酚提取物低（150 mg/（kg·d）（以体质量计，下同），TL）、中（300 mg/（kg·d），TM）、高剂量（600 mg/（kg·d），TH）组。动物在环境相对湿度50%～60%，温度20～25℃，光照/黑暗分别为12 h的SPF级屏障环境内饲养。每天早上分别对实验组小鼠灌胃7 d，空白对照组按体质量（10 mL/kg）灌胃超纯水7 d，灌胃2 h后正常进食、饮水。第7天灌胃2 h后脊椎猝死，取小鼠肝脏，用预冷的生理盐水冲洗血迹，-80 ℃保存。

1.3.3 RNA的提取及real-time RT-PCR

取冻存的小鼠肝脏50 mg，按照试剂盒说明，用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒抽提肝脏组织的总RNA。用紫外分光光度计测总RNA的浓度及OD260nm/OD280nm比值，其中比值均在1.7～2.1之间，说明RNA的纯度可以进行下一步实验，同时进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，观察18S与28S条带，以条带清晰且28S亮度约为18S的二倍为最佳标准；用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒逆转录RNA模板成cDNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行；然后采用SYBR®Premix Ex Taq™（TliRNaseH Plus）试剂盒对mRNA的表达进行相对定量，所有操作均在冰上进行；选择β-肌动蛋白作为内参基因，其中的定量方法采用比较阈值法（2-△△Ct法），计算实验组和空白对照组之间的基因表达水平的差异[16]。引物序列[17-19]见表1。

表1 Real-time RT-PCR引物Table 1 Quantitative real-time RT-PCR primers used in this study

1.3.4 Western blot法提取蛋白

取冻存的肝脏组织80 mg，加1 mL预冷的含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液（主要含NP-40、Tris-HCl（pH 8.0），二胺四乙酸、NaCl），用FastPrep-24核酸蛋白提取仪行匀浆，将匀浆液转移至离心管中。4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液。采用Wang Dongxu[20]及Wang Lihua[21]等的方法并根据实验室的条件加以调整：用BCA法检测蛋白浓度，取所需体积的蛋白质溶液按比例加入5×Loading buffer，100 ℃加热5 min，加热后将样品置于冰水中冷却，分装后存于-80 ℃。所有操作均在冰上进行。将上样液从-80 ℃冰箱取出，100 ℃加热5 min，冷却后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，取空白对照组和3 个实验组各1 个样品，每孔槽内确保可加样品的体积和蛋白总量相等。电泳完毕后将蛋白转移至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭液封闭膜，然后用兔抗多克隆抗体甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，为内参蛋白）、Cyp3a11、Cyp2c37、Cyp2d22作用于4 ℃过夜，复温后用TBST洗膜5次，每次5 min。再与羊抗兔免疫球蛋白（immune globulin G，IgG）-过氧化物酶二抗结合1 h，TBST洗膜5 次，每次5 min，ECL显影成像。显影后将所得的蛋白质条带用Image Lab 5.1软件系统进行半定量分析。

1.4 数据统计分析

数据分析采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，统计方法采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），多重比较检验进行显著性分析，P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp3a11表达水平的影响

图1 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp3a11 mRNA表达的作用Fig. 1 Effects of polyphenols from Tieguanyin on mRNA expression of Cyp3a11 in liver of mice

由图1可知，铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp3a11 mRNA表达的影响。与空白对照组相比，铁观音多酚提取物低剂量组对Cyp3a11 mRNA的表达呈显著诱导作用（P＜0.05），中剂量组对Cyp3a11 mRNA有显著下调作用（P＜0.05），高剂量组对其则无显著影响。因此，铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp3a11 mRNA的表达未呈明显的剂量依赖性。

图2 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp3a11蛋白表达的作用Fig. 2 Effects of Tieguanyin tea polyphenols on the protein expression of Cyp3a11 in liver of mice

图2 反映的是各剂量组中小鼠肝Cyp3a11蛋白表达的半定量结果。由图2可知，与空白对照组相比较，低、中剂量组均对小鼠肝Cyp3a11蛋白的表达无显著影响，其中高剂量组对小鼠肝Cyp3a11蛋白的表达呈显著上调作用（P＜0.05）。

由实验结果可得，在铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp3a11表达的影响作用中，其mRNA表达和蛋白表达的分析结果不大相同。铁观音多酚提取物中剂量都有下调Cyp3a11表达的作用，但其蛋白表达无显著性，低剂量组对Cyp3a11 mRNA的表达呈显著诱导作用，但对蛋白表达却无显著作用；高剂量组对其mRNA的无显著影响，但对Cyp3a11蛋白的表达存在显著的诱导作用。

2.2 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2d22表达水平的影响

图3 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2d22 mRNA表达的作用Fig. 3 Effects of Tieguanyin tea polyphenols on the mRNA expression of Cyp2d22 in liver of mice

图3 是铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2d22 mRNA表达的作用结果。与空白对照组相比，铁观音多酚提取物低剂量组显著诱导Cyp2d22 mRNA的表达（P＜0.05），中、高剂量组对Cyp2d22 mRNA表达的作用甚微，没有显著性影响。

图4 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2d22蛋白表达的作用Fig. 4 Effects of Tieguanyin tea polyphenols on the protein expression of Cyp2d22 in liver of mice

小鼠肝组织Cyp2d22蛋白表达的半定量结果由图4可知，与空白对照组相比较，低剂量组能显著诱导小鼠肝Cyp2d22蛋白的表达（P＜0.05），中剂量组对小鼠肝Cyp2d22的蛋白表达无显著影响，高剂量组对小鼠肝Cyp2d22的蛋白表达有诱导的趋势，无显著性影响，没有剂量依赖关系。

铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2d22表达的影响中，其mRNA表达和蛋白表达的分析结果大致相同，Cyp2d22 mRNA和蛋白表达结果几乎吻合。说明低剂量的铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2d22存在显著的诱导作用，中、高剂量组对其无显著影响。

2.3 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2c37表达水平的影响

图5 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2c37 mRNA表达的作用Fig. 5 Effects of Tieguanyin tea polyphenols on the mRNA expression of Cyp2c37 in liver of mice

由图5可知，相比空白对照组，铁观音多酚提取物低剂量组对小鼠肝Cyp2c37 mRNA的表达呈显著诱导作用（P＜0.05），中剂量组对Cyp2c37 mRNA的表达呈显著抑制作用（P＜0.05），高剂量组对Cyp2c37 mRNA的表达无显著影响。

图6 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2c37蛋白表达的作用Fig. 6 Effects of Tieguanyin tea polyphenols on the protein expression of Cyp2c37 in liver of mice

各剂量组中小鼠肝Cyp2c37蛋白表达的半定量结果由图6可知，与空白对照组相比，铁观音多酚提取物中剂量组能够显著抑制小鼠肝Cyp2c37蛋白表达的作用（P＜0.05），而低、高剂量组存在抑制作用，但没有显著影响。

在铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp2c37表达的影响中，其mRNA表达和蛋白表达的分析结果明显不一致。总体说来，铁观音多酚提取物中剂量组对Cyp2c37的mRNA和蛋白表达都有相一致的显著抑制作用，铁观音多酚提取物低剂量组对Cyp2c37的mRNA有显著的诱导作用，但其对蛋白表达存在一定的抑制作用，高剂量组对Cyp2c37的mRNA表达没有明显作用，但其对蛋白表达呈微弱的抑制作用，但无统计学意义。

3 结论与讨论

本实验从基因转录水平和蛋白表达水平上对铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp450酶系各亚型酶Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37的作用进行了探讨。福建安溪铁观音是一种著名的乌龙茶，已有研究表明，其多酚与其他发酵程度不同茶叶的茶多酚相比多酚提取物的含量较高；且安溪铁观音多酚提取物主要成分与它们也有很大的差别，其成分以儿茶素为主，主要含有表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯等，由于其经过一定程度发酵，还含有少量茶黄素等其他大分子多酚聚合物[22]。目前国内外研究主要集中在茶多酚提取物对人体重要的抗氧化及抗肿瘤作用，而对通过肝药酶的代谢作用研究甚少。

本实验结果中，与空白对照组相比：1）铁观音多酚提取物低剂量组对小鼠肝Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37 mRNA均存在显著诱导作用，但仅诱导Cyp2d22的蛋白表达，对Cyp3a11和Cyp2c37的蛋白表达无显著影响。其原因可能是铁观音多酚提取物主要作用于Cyp3a11、Cyp2c37转录后水平的调控，使其蛋白表达结果与mRNA表达结果不一致。有研究表明，一些成熟mRNA通过核孔复合物后，可能并不与翻译装置结合，最后翻译出少量功能蛋白；蛋白的翻译后修饰作用也不容忽视，例如泛素-蛋白酶体的降解作用也可降低功能蛋白的产生[23]。因此出现铁观音多酚提取物呈现对Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37 mRNA有显著影响，而对其对应的部分蛋白表达却无显著影响。2）中剂量组能够显著抑制小鼠肝Cyp3a11和Cyp2c37的mRNA表达，但仅显著抑制Cyp2c37的蛋白表达，对Cyp3a11的蛋白表达无显著作用，其原因可能是真核细胞中mRNA与蛋白质的表达存在时间和位点的间隔，可能在蛋白量持续增加的时候mRNA已经降解[24]，这就导致检测出铁观音多酚提取物中剂量显著降低Cyp3a11 mRNA的表达，却对其蛋白表达无影响。3）高剂量组对Cyp3a11的mRNA表达无影响，但对其蛋白表达却呈现显著诱导作用。其机制可能仍与上述mRNA与蛋白质的表达存在间隔有关。4）除此之外，许多药物和环境化学物能够通过孕烷X受体、组成型雄甾烷受体等多种核转录因子调节CYP3A4、CYP2C9等多种CYP450亚型的转录，继而影响这些酶的表达和活性[25-26]，铁观音多酚提取物对这些核转录因子的作用值得进一步研究。5）铁观音是一类广受欢迎的茶饮料，许多人即使在用药期间也有饮茶的习惯，因此饮茶对肝药酶的影响势必会加快或减慢合用药物的体内代谢过程，导致代谢性药物相互作用，降低药物疗效或增加药物毒性。因此，系统研究铁观音对肝药酶的影响至关重要。但目前相关报道较少且较分散[27-31]，关于茶多酚对CYP450s的研究及具体机制有待于进一步深入。

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Effect of Polyphenols Extracted from Tieguanyin Tea on the mRNA and Protein Expression Levels of Hepatic Cytochromes P450 (Cyp450s) in Mice

REN Hong1,2, LIU Dong2, ZHENG Shaojie1, YAN Yijing2, SUN Haiyan2,*, MING Jian1,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Shenzhen Key Laboratory of Fermentation, Purif i cation and Analysis, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, China)

In this paper, the effect of polyphenols extracted from Tieguanyin tea on the mRNA and protein expression levels of cytochromes P450 3a11 (Cyp3a11), 2d22 (Cyp2d22) and 2c37 (Cyp2c37) in the liver of mice was explored by real-time reverse transcription polymerase chain reaction（real-time RT-PCR） and Western blot. The results showedthat the polyphenol extract at low dose (150 mg/(kg·d)) significantly induced the mRNA expression of Cyp3a11, Cyp2d22, and Cyp2c37 (P ＜ 0.05) in comparison with the control group, while it significantly induced the protein expression of Cyp2d22 but had no signif i cant effect on the protein expression of Cyp3a11 and exhibited a signif i cant inhibitory effect on the protein expression of Cyp2c37. The polyphenols at middle dose (300 mg/(kg·d)) signif i cantly inhibited the mRNA and protein expression of Cyp3a11 and Cyp2c37 (P ＜ 0.05) but had no signif i cant effect the mRNA and protein expression of Cyp2d22. The polyphenols at high dose (600 mg/(kg·d)), although having no signif i cant effect on the mRNA expression of three enzymes, signif i cantly inhibited their protein expression levels (P ＜ 0.05). Therefore, Tieguanyin tea polyphenols can affect both the mRNA and protein expression levels of Cyp3a11, Cyp2d22 and Cyp2c37 in the liver of mice, suggesting that metabolism-based interactions can occur when they are used in combination with medicines.

Teiguanyin tea; polyphenol extracts; Cyp450; mRNA; protein expression

O625.3

A

1002-6630（2017）07-0201-06 DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707032

康尤. 我国茶叶种类知多少[J]. 新农村, 2012(8): 36.

10.3969/ j.issn.1008-2182.2012.08.036.

任红, 刘冬, 郑少杰, 等. 铁观音多酚提取物对小鼠肝Cyp450s的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(7): 201-206. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201707032. http://www.spkx.net.cn

REN Hong, LIU Dong, ZHENG Shaojie, et al. Effect of polyphenols extracted from Tieguanyin tea on the mRNA and protein expression levels of hepatic cytochromes P450 (Cyp450s) in mice[J]. Food Science, 2017, 38(7): 201-206. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707032. http://www.spkx.net.cn

2016-04-29

广东省科技计划项目（2013B051000089）；深圳市战略性新兴产业发展专项资金资助项目（JCYJ20130331151222011）；深圳市科技计划项目（JCYJ20140901162541286；JCYJ20160530173755124）

任红（1991—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：670643177@qq.com

*通信作者：孙海燕（1972—），女，教授，博士，研究方向为天然活性成分分析及代谢组学。E-mail：susan@szpt.edu.cn明建（1972—），男，教授，博士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：mingjian1972@163.com