山羊GDF—8基因的表达差异与发育性变化分析

管凇+周汉林+侯冠彧

摘 要 为探索GDF-8基因在山羊不同生长阶段的肝脏、心脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中mRNA表达发育性变换规律，采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术对2月龄、3月龄和4月龄的海南本地山羊进行检测。结果显示，GDF-8基因在3月龄的心脏组织中mRNA表达量最高，其次是肾脏和骨骼肌；在2月龄和4月龄时5种组织中GDF-8基因表达量较低，尤其是在心脏组织中几乎不表达；在肝脏和脂肪中的表达依次为4月龄>2月龄>3月龄，且各月龄之间表达差异极显著（p<0.01）；心脏、肾脏和骨骼肌的表达依次为3月龄>4月龄>2月龄，其中，肾脏在不同月龄段表达差异极显著（p<0.01），而心脏和骨骼肌在2月龄和4月龄之间表达差异不显著（p>0.05）。

关键词 GDF-8基因 ；mRNA表达 ；荧光实时定量PCR ；山羊

中图分类号 S827

Abstract In order to explore the mRNA expression differences and developmental changes of GDF-8 gene in liver， heart， kidney， fat， and skeletal muscle of goat in different growth stages， in this paper， using SYBR Green real-time fluorescent quantitative PCR technology for 2 months， 3 months and 4 months age of Hainan native goat for testing， The results showed that， the GDF-8 gene mRNA expression level in heart was the highest in months 3， and then in liver. The expression level of the five tissues in months 2 and months 4 was very low， especially， the heart tissue in months 2 and months 4 almost have no expression. The expression pattern of liver and fat in the three stage was： months 4>months 2>months 3， the expression differences among the three stages was very significantly（P<0.05）. The expression pattern of heart， kidney and skeletal muscle in the three stages was： months 3> months 4>months 2， the expression differences of kidney among the three stages was very significantly（P<0.05）， the expression differences of heart and skeletal muscle was not significant between months 2 and months 4.

Key words GDF-8 ；mRNA expression ；SYBR green real-time PCR ；goat

动物的生长发育是受基因表达调控的复杂过程，取决于相关基因在不同发育阶段、不同肌肉组织细胞中的特异性差异表达。肉质性状是畜禽动物的重要经济性状， 而GDF-8基因是与动物的肉质性状密切相关的候选基因，对肌肉的生长起负调控作用，又被命名为肌肉生长抑制素基因。近年来的研究结果表明，GDF-8基因除了对肌肉生长具有负调控作用外，对其他的生理功能具有一定的调理作用，如对动物的脂肪沉积、肌蛋白的合成与分解、骨骼肌的生長发育等都具有一定的调控。Kambadur等[1]发现该基因的突变导致处于同一条件下饲养的双肌牛和普通牛，两者的肉质差异非常大，前者肉质要比后者好1.3倍。whittemore等[2]将GDF-8抗体注射到成年鼠体内发现该成年鼠的骨骼肌出现骤增的情况。GDF-8基因作为一种肌肉生长负调控因子，在畜牧生产中具有一定的实践意义，研究GDF-8基因的表达或影响其表达产物活性等，对畜禽肌肉生长的调控、肌肉品质改善等具有重要意义，可大大提高畜禽的瘦肉产量，提高经济效益。海南黑山羊是中国热带地区优良的地方山羊品种，长期经热带地区自然生态环境的影响，形成独特的品种特性和生态特性，在海南各市县均有分布。其肉用性能好、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、是中国热区规模化健康养殖的宝贵品种资源。笔者以同等条件下饲养的海南黑山羊为研究对象，探索GDF-8基因在山羊肝脏、心脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中的表达规律，不仅为GDF-8基因在山羊不同组织中的表达规律提供科学的遗传学资料，同时，对海南黑山羊的良种保留与繁育以及肉品质的改善提供一定的借鉴依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选取中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所实验羊场的海南黑山羊为研究对象，选择在相同营养水平，相同饲养环境下喂养的2月龄、3月龄和4月龄的公羊各3只屠宰，屠宰后取肝脏、心脏、肾、脂肪和骨骼肌，用锡纸包好投入液氮中待用。

1.1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂盒（Maxwell 16 Total RNA Purification Kit）购自普洛麦格公司，反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒均购自大连宝生物有限公司，移液枪、枪头、琼脂糖和Marker2000等购自海口光威生物有限公司。核酸提取仪Maxwell 16（Promega公司），eppendorf实时荧光定量PCR仪（海口光威生物有限公司），B-iometra PCR仪（德国德国 Biometra公司），凝胶成像系统（法国Vilber）。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取与反转录

各组织总RNA按照试剂盒说明进行。提取的RNA分别利用浓度为0.8 %的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯度和浓度，再将其稀释，4 ℃保存备用。反转录体系为：Oligo dT Primer（50 pmol/L）1.0 μL，终浓度20 pmol，5×prime ScriptTM Buffer（实时）20 μL，终浓度1 pmol，Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I 1 μL， Random 6 mers （0.1 mm）1 μL，终浓度0.05 nmol，Total RNA 1 μL，Rnase Free ddH2O到15 μL。反应条件：37 ℃反转录15 min，85 ℃反转录5 s。反应结束后，加入70 μL的RNaseFree ddH2O，混合，-30 ℃保存备用。

1.2.2 引物合成

在GenBank查询已知的序列为参照，用Primer5.0引物设计软件优化生成评分最高的引物序列送至上海生物工程科技有限公司进行合成，引物序列详见表1。

1.2.3 定量PCR反应

反应体系24 μL，其中SYBR Premix Ex TaqTM12 μL、引物（10 umol/L）1 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 10 μL，95℃预热30 s，PCR反应程序为：95 ℃变性5 s；56.8 ℃退火20 s；72 ℃ 15 min，43个循环。最后以扩增曲线和溶解曲线为依据，对数据进行分析。

1.3 数据分析

采用2-△△Ct度量法对GDF-8基因的mRNA相对表达量进行计算，参照Winer等[3]的方法。将β-Actin作为内参基因，针对目的基因进行标准化校准。再依托SPSS 14.0统计软件，对所得数据进行处理。

2 结果

2.1 GDF-8基因在不同月龄阶段5种组织中的表达差异

GDF-8基因在山羊不同生长时期5种组织中的mRNA表达变化见图1。结果显示，在2月龄山羊肝脏、心脏、骨骼肌等部位中，GDF-8基因的mRNA表达量处于低水平状态，且各种组织间的表达量差异极显著（p<0.01），表达模式为：肝脏>肾脏>骨骼肌>脂肪>心脏，该基因在2月龄的心脏组织中几乎不表达。3月龄时，该基因在肾脏、心脏和骨骼肌里的表达量极显著升高，且3月龄时，该基因在心脏里的表达量最高，其次是肾脏和骨骼肌，在肝脏和脂肪组织中表达量极低，几乎不表达，表达模式为：心脏>肾脏>骨骼肌>肝脏>脂肪。4月龄时，该基因在各种组织中的表达量又极显著下降，特别是心脏组织中的表达量又下降到最低水平，几乎不表达，但是在脂肪和肝脏组织中的表达量却明显上升，骨骼肌和肾脏组织中的表达相对稳定，表达模式为：脂肪>骨骼肌>肾脏>肝脏>心脏。

2.2 GDF-8基因在同一种组织、不同月龄段的mRNA表达发育性变化

GDF-8基因在山羊同一种组织、不同月龄段的mRNA表达变化见图2。结果显示，该基因在肾脏组织中的表达模式为：3月龄>4月龄>2月龄，各月龄之间表达差异显著；在肝脏中的表达模式为：4月龄>2月龄>3月龄，各月龄之间表达差异显著；在心脏中的表达模式为：3月龄>4月龄>2月龄，2月龄和4月龄的表达不显著；在脂肪中的表达模式为：4月龄>2月龄>3月龄，各月龄之间表达差异显著；在骨骼肌中的表达模式为：3月龄>4月龄>2月龄，2月龄和4月龄表达差异不显著。

3 讨论与结论

GDF-8基因在哺乳动物发育期和成年期的骨骼肌中广泛表达。近年来，人们在不同物种的各种组织中也开展了广泛的研究，Ji等[4]对猪的研究发现，GDF-8基因主要在骨骼肌中表达，在心脏、脂肪、骨髓、乳腺、肺、脑、舌、小肠、肾脏和肝脏中也有少量表达。在家禽中，除在骨骼肌和心肌中表达外，在脑、肠和脾脏中也有少量表达。胡兰等[5]选取了大骨鸡为研究对象，对其各组织中GDF-8基因的表达水平进行分析可知，在大骨鸡所有组织中，尤以骨骼肌GDF-8基因表达水平最高，其次为肾脏、心肌等组织。但在肺脏和肝脏中却没有发现该基因的表达。杨家大[6]等对贵州山羊的研究揭示，GDF-8基因在背最长肌和心等组织中的表达处于低水平状态；与心肌相比，半膜肌和背最长肌中GDF-8基因的表达水平较高，表达模式为肝和皮下脂肪>肾和肺>半膜肌。张锐等[7]研究结果表明，在猪的所有组织中，只有骨骼肌和心肌存在GDF-8基因表达，其他组织并无发现。 Kubota等[8]选取了鸡胚为研究对象，对其心脏、肾、骨骼肌和肝脏组织中GDF-8基因的表达进行分析，根据其分析结果可知，前3种组织均存在GDF-8基因表达，而肝臟组织则并无发现。尹阔等[9]选取了绵羊为研究对象，对其各组织GDF-8基因的表达进行分析，分析结果显示，无论是卡拉库尔羊还是和田羊，其心脏和肺脏均没有发现GDF-8基因表达，在其心脏、肾脏等组织中均存在GDF-8基因表达。梁婧娴等[10]选取了绵羊为研究对象，对其各组织GDF-8基因表达情况进行分析，根据其分析结果可知，在绵羊的所有组织中，只有腿肌存在GDF-8基因表达。王娜等[11]通过对鸡的各个组织进行研究后发现，在鸡的骨骼肌中存在大量的GDF-8基因表达，在其心脏也有少量的表达，这些学者还指出，脂肪组织、肺脏、肾脏等组织中GDF-8基因的表达微乎其微。祖玲玲等[12]通过研究后发现，GDF-8基因在1-4月龄的哈萨克羔羊肌肉组织中mRNA表达量均无显著性差异，略微呈上升趋势，5月龄达到最高峰，6月龄迅速下降。管凇[13]对2月龄、3月龄、4月龄和12月龄的海南黑山羊腰肌、背肌和腿肌进行研究结果表明，GDF-8基因在背肌里的表达量最高，腿肌里的表达量较低。潘英树等[14]对鹅的研究结果表明，在鹅的心脏、肝脏、骨骼肌等组织中都存在GDF-8基因表达。祖玲玲[15]等通过研究后发现，在也木勒白羊的各个生长阶段中，尤以3个月大的也木勒白羊肌肉中GDF-8基因的表达水平最低，其他生长阶段均持平；在0月龄脂肪中表达量相对较低，表达水平会随着生长阶段的递增而提升，直到生长到5月龄以后，表达量又会随着生长阶段的递增而下降。本研究结果显示，GDF-8基因在在海南黑山羊2月龄的肝脏、心脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中的mRNA表达量较低，且各种组织间的表达量差异显著，在2月龄的心脏组织中几乎不表达。3月龄时，该基因在肾脏、心脏和骨骼肌里的表达量显著升高，且3月龄时，该基因在心脏里的表达量最高，其次是肾脏和骨骼肌，表达水平最低的是肝脏和脂肪组织，表达量微乎其微，生长到4月龄时，GDF-8基因在各种组织中的表达量又显著下降，特别是心脏组织中的表达量又下降到最低水平，几乎不表达，但是在脂肪和肝脏组织中的表达量却明显上升，骨骼肌和肾脏组织中的表达相对稳定。目前而言，GDF-8基因在不同物种的不同组织中的表达规律参差不齐，没有固定的模式；同一个物种也受饲养条件、不同生长阶段采集的样品、实验误差等影响，造成结论不一。关于GDF-8基因对肉质性状的调控机制需要更多试验样本进行更广泛更系统的研究。本实验结果为揭示山羊GDF-8基因更多生理功能提供一定的参考依据。

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