Toonaciliatin A在体内外抑制胃癌MKN45细胞增殖并诱导细胞凋亡

丁 怡， 卢新刚， 孙书焰， 戴 俊

1.复旦大学附属中山医院药剂科，上海 200032 2.复旦大学附属华东医院中医科，上海 200040 3.上海市闵行区中医医院中医科，上海 201103 4.复旦大学附属华东医院药剂科，上海 200040

·论 著·

Toonaciliatin A在体内外抑制胃癌MKN45细胞增殖并诱导细胞凋亡

丁 怡1， 卢新刚2， 孙书焰3， 戴 俊4*

1.复旦大学附属中山医院药剂科，上海 200032 2.复旦大学附属华东医院中医科，上海 200040 3.上海市闵行区中医医院中医科，上海 201103 4.复旦大学附属华东医院药剂科，上海 200040

目的： 探讨中药单体Toonaciliatin A体内外对人胃癌MKN45细胞增殖和凋亡的影响。方法： 体外培养MKN45细胞，采用不同质量浓度的Toonaciliatin A (15、30、60 μg/mL) 分别处理48 h，MTT法检测细胞增殖活性；Annexin V-FITC/PI法染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率。建立人胃癌MKN45细胞的BALB/c裸鼠移植瘤模型，采用不同剂量的Toonaciliatin A(10、20、40 mg/kg)给药21 d，检测移植瘤质量及裸鼠体质量；免疫组织化学法检测各组移植瘤组织中caspase-3蛋白的表达水平。结果： Toonaciliatin A体外可有效抑制MKN45细胞增殖，并诱导MKN45细胞凋亡，药物处理组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，Toonaciliatin A给药组移植瘤质量明显降低(P<0.05)。Toonaciliatin A体内可诱导移植瘤组织中caspase-3蛋白表达增加(P<0.05)。结论： Toonaciliatin A体内外能有效抑制胃癌MKN45细胞增殖并诱导细胞凋亡。

胃肿瘤；抗肿瘤药，植物；柠檬苦素类；异种移植模型抗肿瘤试验；Toonaciliatin A

近年来，随着肿瘤发病率的逐年提高，恶性肿瘤逐渐成为全球主要的致死因素[1]。胃癌是我国人群主要的恶性肿瘤之一[2-3]，其发病与地域、饮食习惯及人种等均有较大关联[4]。胃癌的预后与其病理分期、部位、组织学类型、生物学行为以及治疗措施有关。因此，临床急需研发疗效好且安全的抗肿瘤新药。Toonaciliatin A是从思茅红椿(ToonaciliataRoem.var.henryi)中提取的柠檬苦素类似物[5-6]。本研究观察Toonaciliatin A对人胃癌MKN45细胞在体内外生长的抑制作用，分析其诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖的可能机制，探讨其用作胃癌抗肿瘤药物的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 RPMI 1640培养液、胰蛋白酶和澳洲胎牛血清均购于美国Gibco公司。四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]购自美国Sigma公司。1%青霉素-链霉素双抗溶液和二甲基亚砜(dimethylsulphoxide，DMSO)购于上海碧云天生物技术有限公司。Toonaciliatin A标准品(纯度大于98%，批号为20120356)由上海诗丹德生物技术有限公司提供。在体外实验中，将Toonaciliatin A标准品溶解于DMSO中，配制成所需要的给药浓度，并保证DMSO在培养液中的体积占比不超过千分之一。在体内实验中，将Toonaciliatin A标准品溶解于含5% DMSO的0.9%氯化钠溶液中，并达到所需要的给药浓度。仪器：二氧化碳培养箱为Heal Force公司产品。倒置显微镜(CK40)为日本Olympus公司产品。酶标仪(Star Fax-2100)购自美国Awareness公司。流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。

1.2 实验动物 SPF级8周龄BALB/c裸鼠，体质量为(20±1) g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。所有裸鼠均由上海中医药大学动物实验中心在SPF级实验室饲养，光暗周期为12 h∶12 h，保证24 h通风换气，并且用无菌饲料及灭菌纯净水饲养，温度保持在20～26℃，湿度稳定在40%～70%。

1.3 细胞来源及培养条件 MKN45细胞购于中国科学院上海细胞库。用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的RPMI 1640培养液，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养MKN45细胞；每3 d更换培养液1次。

1.4 MTT法检测体外细胞活性 将混匀的MKN45细胞悬液接种于96孔板上，每组设6个复孔。待细胞生长至合适融合度时，加入Toonaciliatin A并使药物最终质量浓度分别为15、30、60 μg/mL，培养48 h。分别于加药处理12、24、48 h时，每孔加入5 μL(5 mg/mL)的MTT溶液，反应4 h后弃去培养液，并加入150 μL DMSO，振荡溶解，酶标仪双波长法测量光密度(D)值，波长设定为570、630 nm。细胞存活率(%)=实验组D值/空白组D值×100%。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI法检测体外细胞凋亡 将混匀的MKN45细胞悬液接种于24孔板上，每组设3个复孔。待细胞长至合适融合度时，加入Toonaciliatin A并使其最终质量浓度分别为15、30、60 μg/mL，培养48 h。胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养液终止消化，吹打成细胞悬液。按照AnnexinⅤ-FITC/PI检测试剂盒说明书操作，最后上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.6 MKN45细胞移植瘤模型的建立及给药 选对数生长期的人胃癌MKN45细胞，制备成细胞悬液。将密度为5×106/mL的细胞悬液(200 μL)注射于BALB/c裸鼠右侧腹腔皮下，建立裸鼠移植瘤模型。待肿瘤生长到体积约100 mm3后，随机分组，设溶媒对照组和不同剂量(10、20、40 mg/kg)的Toonaciliatin A组(n=6)。Toonaciliatin A组采用腹腔注射的方法给予上述3个剂量的Toonaciliatin A治疗，溶媒对照组则给予同等剂量的含5% DMSO的0.9%氯化钠溶液。共给药21 d，记录裸鼠开始和最终的体质量。给药21 d后，颈椎脱离法牺牲裸鼠，取出移植瘤，电子天平称取瘤体质量，计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-给药组平均瘤体质量/阴性对照组平均瘤体质量)×100%。

1.7 免疫组织化学法检测caspase-3表达水平 将末次给药的MKN45细胞裸鼠移植瘤样本取出，10%甲醛固定液固定，石蜡包埋，层厚5 μm切片。加入caspase-3一抗(Abcam, 体积稀释比例为1∶500)反应过夜，再加入对应二抗，光学显微镜下观察caspase-3的免疫染色结果。

1.8 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用中效直线回归法计算细胞半数抑制浓度(IC50)。多组间数据分析采用方差分析法。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 Toonaciliatin A体外对胃癌细胞增殖的抑制效率 MTT法检测结果(图1)显示：不同质量浓度的Toonaciliatin A作用不同时间后，胃癌MKN45细胞增殖活性均被明显抑制，且该抑制作用呈时间和浓度依赖性(P<0.05)。Toonaciliatin A对MKN45细胞株的IC50为(32.56±6.25) μg/mL。

2.2 Toonaciliatin A体外诱导胃癌细胞凋亡 结果(图2)显示：对照组MKN45细胞的凋亡率在10%以下，细胞生长良好；而15、30、60 μg/mL Toonaciliatin A处理48 h后，MKN45细胞凋亡率分别为14.49%、32.70%、54.47%。与溶媒对照组相比，低、中、高3个剂量的Toonaciliatin A组细胞凋亡率均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 MTT法检测Toonaciliation A作用后胃癌MKN45细胞存活率

图2 流式细胞仪检测Toonaciliation A作用后胃癌MKN45细胞凋亡率

2.3 Toonaciliatin A给药抑制裸鼠体内移植瘤的生长 结果(表1)显示：随着Toonaciliatin A给药剂量的升高，裸鼠体内抑瘤率也逐渐增高。与溶媒对照组相比，低、中、高3个剂量的Toonaciliatin A组移植瘤体质量均明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。同时，4组荷瘤裸鼠在给药21 d内均无中毒和死亡现象发生，各组裸鼠体质量在Toonaciliatin A治疗前后与对照组相比，差异无统计学意义。

表1 Toonaciliatin A给药对裸鼠体内MKN45移植瘤生长的影响

*P< 0.05，**P<0.01与溶媒对照组相比

2.4 Toonaciliatin A给药后裸鼠体内移植瘤组织中caspase-3水平上调 免疫组织化学法检测结果显示，10、20、40 mg/kg Toonaciliatin A给药治疗后，裸鼠体内移植瘤组织中caspase-3蛋白表达水平均明显升高(图3)。结果证实，Toonaciliatin A可通过诱导细胞凋亡来抑制裸鼠体内胃癌MKN45细胞移植瘤的生长。

图3 Toonaciliatin A给药后裸鼠体内移植瘤组织caspase-3蛋白表达水平的变化

3 讨 论

肿瘤的发生与发展是多种生物因素导致的细胞过度增殖和(或)细胞凋亡被抑制的结果[7]。细胞凋亡被认为是抗癌药物研究和开发的最有效靶点之一，因此，通过药物或其他手段诱导细胞凋亡来治疗癌症是目前肿瘤学研究的重点[8]。在抗癌新药研发的进程中，植物化学物质已成为最丰富的新药来源[9]。植物提供了广泛且多样性的用于肿瘤治疗的化学结构[10]。人们正在不断探索从植物天然物质中发现新的抗癌药物，而现代技术促进了天然来源的新化合物的筛选进程，并使单体筛选成为一种有效方法[11]。

细胞凋亡是药物抑制细胞增殖的主要途径之一。Caspase-3作为细胞凋亡中最关键的一种酶，其活化将引起细胞发生不可逆性凋亡，是细胞凋亡的执行者[11]。本实验中，Toonaciliatin A可以有效提高动物体内移植瘤组织中caspase-3的表达水平，提示Toonaciliatin A可通过上调caspase-3的表达，诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。本研究初步证实Toonaciliatin A在体内外具有抑制胃癌MKN45细胞增殖的作用。然而，药物的体内给药是否能达到其在体外发挥作用的活性剂量，这是药物是否具备临床应用前景的关键。因此，Toonaciliatin A的药代动力学数据是今后研究的方向之一。

综上所述，Tonaciliatin A可以在体外抑制人胃癌MKN45细胞增殖，且诱导MKN45细胞凋亡；同时，体内实验结果证实，Toonaciliatin A可以有效抑制人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，而且该抑瘤效应的分子机制可能与上调caspase-3表达及诱导人胃癌细胞凋亡相关。另外，本研究还发现21 d的Toonaciliatin A给药并未对裸鼠的体质量产生影响，且裸鼠无中毒和死亡等情况发生。因此，本研究为临床应用Toonaciliatin A治疗胃癌及其他恶性肿瘤提供了一定的实验依据。

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[本文编辑] 叶 婷， 张艺鸣

Toonaciliatin A inhibits proliferation and induces apoptosis of gastric cancer MKN45 cellsinvitroandinvivo

DING Yi1, LU Xin-gang2, SUN Shu-yan3, DAI Jun4*

1.Department of Pharmacy, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Department of Traditional Chinese Medicine, Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China 3.Department of Traditional Chinese Medicine, Shanghai Minhang District Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201103, China 4.Department of Pharmacy, Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China

Objective： To investigate the effects of traditional Chinese medicine monomer Toonaciliatin A on proliferation and apoptosis of human gastric cancer cell line MKN45invitroandinvivo.Methods： MKN45 cells were culturedinvitroand treated with Toonaciliatin A (15, 30, and 60 μg/mL) for 48 h.Then the cell viability was measured by MTT assay.The apoptosis were determined by flow cytometry using Annexin V-FITC/PI assay.The BALB/c nude mouse xenograft model of MKN45 cells was established and administrated with Toonaciliatin A (10, 20, and 40 mg/kg) for 21 days, then the weights of xenograft tumors and mouse were calculated, and the expression of caspase-3 protein in tumor tissues was detected by immunohistochemical method.Results： As compared with the control group, Toonaciliatin A inhibited effectively the proliferation of MKN45 cells, and induced apoptosis of MKN45 cellsinvitro(P<0.05).In the nude mouse xenograft model of MKN45 cells, the tumor weight of Toonaciliatin A treatment group was significantly decreased as compared with that of the control group (P<0.05).Toonaciliatin A induced the expression of caspase-3 proteininvivo(P<0.05).Conclusions： Toonaciliatin A is an effective anti-tumor Chinese medicine monomer.

stomach neoplasms; antineoplastic, phytogenic; limonins; xenograft model antitumor assays; Toonaciliatin A

2016-08-13 [接受日期] 2016-11-21

上海市科学技术委员会课题(13401907000).Supported by Foundation of Shanghai Municipal Science and Technology Commission (13401907000).

丁 怡，药师.E-mail: 715053877@qq.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-62483180-80511, E-mail: xiaoxiaojack323@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160913

R 735.2; R979.19

A