UPLC法分离饮料中7种合成着色剂的研究

赵 卉，胡梦坤，岑 琴，彭 红

（沈阳产品质量监督检验院，沈阳 110022）

人工合成色素是以苯、甲苯、萘等化工产品为原料，经磺化、硝化、卤化、偶氮化等一系列有机反应制成的。大量的研究报告指出，几乎所有的合成色素都不能向人体提供营养物质，某些合成色素甚至会导致生育力下降、畸胎等。因此，我国《GB2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中对合成着色剂的使用有明确限量。超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）与传统的液相色谱（HPLC）相比，可大大改善分析速度、分离度和灵敏度，在食品安全、环境分析、药物开发等领域应用广泛。通过改变试验条件，建立UPLC对饮料中柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红7种人工合成着色剂的分离分析方法，为快速识别和检测合成着色剂提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 Waters2695高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器）：美国waters公司；色谱柱Waters RP18（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）；电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；超纯水制备系统：美国Milli-Q公司。

1.1.2 试剂 柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红标准品 （纯度＞99%）由DR.Ehrenstorfer GmbH生产；甲醇（色谱纯）由美国fisher公司生产；乙醇、氨水、聚酰胺粉、甲酸、柠檬酸、乙酸铵均为分析纯。

1.2 样品前处理

准确称取试样 20 g（精确至 0.01 g），置于 100 mL烧杯中，加热驱除 CO2；加柠檬酸（20 g/100 mL）调节试样pH值为6，加热至60℃，将1 g聚酰胺粉倒入试样中，搅拌抽滤；用60℃水洗涤后，再用甲醇-甲酸（6+4）溶液洗涤3～5次，再用水洗至中性；用乙醇-氨水-水（7+2+1）混合液解析 3～5 次，每次 5 mL，收集解吸液，加水定容；用 0.45 μm 滤膜过滤，待用。

1.3 色谱条件选择

选择甲醇及 0.02 mol/L 乙酸铵溶液 （称取 1.54 g乙酸铵，加水至 1 000 mL，溶解，经 0.45 μm 微孔滤膜过滤）作为流动相，进行梯度洗脱，流速为 0.6 mL/min，柱温35℃。

在190～700 nm之间进行全波长扫描，确定7种合成着色剂最大吸收波长分别为：柠檬黄257.8 nm；新红 505.3 nm；苋菜红 216.4 nm；胭脂红 215.2 nm；日落黄 234.1 nm；亮蓝 627.5 nm；赤藓红 530.9 nm。由此选择254 nm作为柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄的检测波长，530 nm作为赤藓红的检测波长，630 nm作为亮蓝的检测波长。

梯度洗脱条件见表1。在以上色谱条件下进样0.4 μL，以色谱峰面积外标法定量，测得7种合成着色剂的色谱图，如图1—3所示。

1.3 标准曲线

准确称取按其纯度折算为100%的柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红标准样品各0.1 g，加水定容于100 mL容量瓶内，配成1 000 mg/L混合标准储备液。于4℃冷藏柜内储存，有效期3个月。

分别吸取上述标准储备液 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成浓度为 2.0，5.0，10，20，50 mg/L 的混合标准工作溶液。 经0.45 μm 滤膜过滤，在 1.3 色谱条件下进样 0.4 μL，根据浓度与峰面积的关系绘制标准曲线。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution requirement

图1 柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄出峰色谱图Figure 1 Chromatogram of tartrazine，new red，amaranth，ponceau and sunlet yellow appearance

图2 赤藓红出峰时间图Figure 2 Appearance time of erythrosine

图3 亮蓝出峰时间图Figure 3 Appearance time of brilliant blue

1.4 方法回收率及精密度

为考察方法的可靠性，测定7种合成着色剂进行加标回收率。将合成着色剂标量为检出限 （0.5 mg/kg，0.2 mg/kg）及 10 倍检出限（5 mg/kg）的样品按照1.2提取方法提取6份，计算回收率及精密度。

2 结果与分析

2.1 线性范围及检出限

色谱峰高为噪声高3倍（S/N＝3）相对应的浓度为检出限。线性方程、相关系数、线性范围及检出限见表2。

从表2可以看出，7种合成着色剂在线性范围内的线性关系良好。

2.2 方法回收率及精密度

通过加标回收率试验，对方法进行回收率和精密度测定，结果见表3。

由表3可知：7种合成着色剂的平均回收率为91.7%～104.1%，相对标准偏差为 0.1%～3.0%（n＝6）。表明该方法精密度、准确度能满足分析要求。

3 结论

建立的UPLC法具有以下特点：1）分析速度快，分离7种人工合成色素仅需3 min，而文献报道的HPLC法需12 min，毛细管电泳法需15 min。2）对于7种人工合成着色剂分离效果好。由于采用小颗粒填充的短柱，因此具有较高的柱效和较低扩散体积。

试验采用梯度洗脱程序，使柠檬黄、新红很好地分离，灵敏度也有明显提高。使用PDA双通道波长检测，各色素特别是亮蓝的检测灵敏度有较大提高，7种色素的检出限为 0.2～0.5 mg/kg，回收率为 91.7%～104.1%，线性相关系数 r＞0.999 5。

综上所述，试验建立的使用UPLC同时检测食品中人工合成着色剂的方法，适用于实际饮料样品检测工作。

表2 7种人工合成色素的线性范围、线性关系、相关系数和检出限Table 2 Liner range，linear equations，correlation coefficients and detection limit of 7 synthetic colorants

表3 7种合成色素加标回收试验Table 3 Mark recovery test of 7 synthetic colorants

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