辣椒素对体外肝细胞脂质代谢的影响研究*

孙 玉，刘 佳，宁 波,杨朝霞△

(1.重庆医科大学附属第二医院消化内科 400010；2.湖北省武汉市普仁医院消化与肝病科 430081)

论著·基础研究

辣椒素对体外肝细胞脂质代谢的影响研究*

孙 玉1，刘 佳2#，宁 波1,杨朝霞1△

(1.重庆医科大学附属第二医院消化内科 400010；2.湖北省武汉市普仁医院消化与肝病科 430081)

目的 探讨辣椒素对脂肪变肝细胞内脂质沉积的影响及自噬表达情况，为脂肪性肝病防治的研究提供新的思路和靶点。方法 用油酸(40 μg/mL)诱导肝原代细胞LO2细胞株建立非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型。实验分为空白对照组、油酸组、辣椒素组[油酸+辣椒素(100 μmol/L)]。油红O染色和三酰甘油试剂盒检测肝细胞内脂肪变程度；Western blot检测自噬体标记分子p62和LC3的表达水平并计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。结果 40 μg/mL油酸处理LO2细胞24 h后，油红O染色观察，油酸组肝细胞中可见大小不等的橘红色脂滴，而空白对照组无明显橘红色脂滴形成，油酸在体外成功建立NAFLD模型。与油酸组相比，辣椒素组肝细胞内三酰甘油水平显著降低(P<0.05)，脂滴明显减少，p62蛋白水平明显降低(P<0.05)，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显上调(P<0.05)。结论 在体外利用油酸诱导LO2细胞株建立NAFLD模型，辣椒素刺激NAFLD细胞，上调NAFLD细胞自噬水平，减少细胞内脂质沉积，但具体机制还需进一步研究。

油酸；辣椒辣素；非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD) 是一种无过量酒精摄入，由遗传-环境-代谢应激相关因素所致的以肝细胞内脂质异常堆积为主要表现的临床病理综合征，与2型糖尿病、高血压和心脑血管疾病密切相关。近年，随着我国经济水平的提高，人们生活方式及膳食结构发生了显著改变，NAFLD的发病率逐年增高，并出现低龄化，严重危害公众健康。我国流行病学调查显示，南方地区NAFLD发病率低于北方，该现象除了与经济水平及生活方式有关外同时饮食结构也密切相关[1]。NAFLD发病机制尚未完全明确，探索NAFLD的发病机制，寻求有效可行的治疗方法成为当下研究热点。辣椒素(capsaicin)是辣椒的主要成分，而辣椒是世界各地广泛被消费的香辛料及蔬菜。随川菜、火锅在国内外的迅速发展，引发了人们对辣椒素的关注。早前有研究报道辣椒素具有抗炎、镇痛、抗氧化等功效[2-4]。现有对于辣椒素的研究主要集中在抗肿瘤方面[5]，而辣椒素降脂方面的研究相对薄弱。有研究证实，在小鼠肝组织中，辣椒素可以促进脂质分解，减少脂质沉积[6]。并且辣椒素能上调血管平滑肌细胞自噬表达，减少血管平滑肌细胞中泡沫细胞的形成[7]。另有实验表明，自噬的增加可以减少肝脏脂质的沉积，而自噬功能受损同样可以导致肝细胞脂质的异常沉积[8]。本研究用油酸作用于人正常肝细胞株LO2构建体外NAFLD细胞模型，再加用辣椒素处理脂肪变肝细胞，探讨辣椒素对脂变肝细胞内脂质沉积的影响及自噬表达情况，为脂肪性肝病防治的研究提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人正常肝细胞株LO2由重庆医科大学肝病研究所提供。胎牛血清(Gibco公司)，三酰甘油检测试剂盒(长春汇力公司)，辣椒素、油红O染色剂(Sigma公司)，兔抗p62多克隆抗体(货号：SC-25730)、兔抗LC3多克隆抗体(Santa Cruz公司,货号：SC-292354)，青霉素-链霉素溶液(100×，碧云天公司)，蛋白提取试剂盒(凯基公司)，RPMI1640培养基、0.25%胰酶(Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 构建细胞模型及分组 LO2细胞用含10%胎牛血清、1%青链双抗的RPMI1640培养基进行培养。当细胞铺满瓶底，用0.25%胰蛋白酶处理细胞进行传代培养。后续实验所用细胞为5 d以内，处于对数生长期的细胞。每2～3天传代1次，传3代后的细胞可用于实验。根据前期实验结果[9]，MTT 检测提示油酸浓度超过40 μg/mL时吸光度值下降明显，对细胞增殖影响较大，故选取40 μg/mL作为油酸最佳诱导浓度，以24 h为最佳作用时间。实验分组：空白对照组为10%FBS的RPMI1640培养基培养24 h；油酸组为10%FBS的RPMI1640培养液+油酸(40 μg/mL)培养24 h；辣椒素组为10%FBS的RPMI1640培养液+油酸(40 μg/mL)+辣椒素(100 μmo/L)培养24 h。

1.2.2 油红O检查各组LO2细胞内脂滴水平 预先将1 cm×1 cm大小的盖玻片置放于培养板内，5×104/mL LO2分别接种，每6孔为1个样本，细胞贴壁后开始干预，分别于0、24 h后取出，用PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，油红O染色，60% 异丙醇脱底色，苏木精细胞核复染，水封片，倒置显微镜下观察细胞内橘红色，脂滴水平并拍照。

1.2.3 检查细胞内三酰甘油水平 将细胞接种于培养板内，每6孔为1个样本，细胞贴壁后开始干预，分别于0、24 h后收集细胞，反复冻融裂解细胞，12 000 r/min离心20 min，取上清检测三酰甘油水平，按试剂盒说明进行操作，BCA法检测蛋白水平，计算每毫克蛋白所对应的三酰甘油水平。

1.2.4 Western blot检查肝细胞自噬蛋白p62及LC3的表达 按总蛋白提取试剂盒说明步骤提取细胞中总蛋白，BCA法进行蛋白定量，分装后-80 ℃保存，避免反复冻融。蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入兔抗LC3多克隆抗体(1∶1 000稀释)、兔抗p62多克隆抗体(1∶1 000稀释)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)，ECL显影，以β-actin为内参照。Quntity one4.52图像分析软件进行图像分析，将每个样本的积分光密度值与β-actin的积分光密度值相比的值，代表其蛋白水平。

2 结 果

2.1 油酸在体外成功诱导建立NAFLD模型 油酸组细胞中即可见大小不等的橘红色脂滴，而空白对照组无明显橘红色脂滴形成。见图1。

A:空白对照组;B:油酸组。

图1 油红O染色观察NAFLD细胞模型肝细胞内脂滴变化(×200)

2.2 辣椒素对NAFLD细胞脂质沉积影响 辣椒素组细胞脂滴明显少于油酸组。见图2。

2.3 辣椒素对脂肪变细胞自噬标志性蛋白p62及LC3-Ⅱ/LC3-I比值的影响 结果显示，辣椒素组较油酸组p62蛋白水平明显降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-I比值明显升高(P<0.05)。见图3。

2.4 辣椒素对NAFLD细胞内三酰甘油水平的影响 油酸组三酰甘油水平56.65 μg/mg，与空白对照组24.28 μg/mg、辣椒素组34.62 μg/mg比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

A:空白对照组;B:油酸组;C:辣椒素组。

图2 油红O染色观察各组LO2肝细胞内脂滴变化(×200)

A:p62、LC3的Western blot;B:p62蛋白相对表达量;C:LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值；a:P<0.05,与空白对照组比较；b:P<0.05,与油酸组比较。

图3 Western blot检测各组LO2肝细胞p62、LC3的蛋白表达

a:P<0.05,与空白对照组比较；b:P<0.05,与油酸组比较。

图4 各组LO2肝细胞内三酰甘油水平

3 讨 论

NAFLD是代谢综合征在肝脏的表现，近年来NAFLD发病率逐渐增加，成为当今常见的慢性疾病及公共卫生问题。其发病机制尚未完全明确，治疗方法具有一定的局限性。探索安全有效、经济的治疗方法是当前医务及科研工作人员迫切的任务。辣椒素是辣椒的主要成分，全世界人口中有20%食用辣椒，而我国是主要的辣椒生产及食用大国[10]。依据人们日常经验和一些文献报道，食用辣椒具有一定的减肥效果[11]，其简单易得，食用安全的特性引发了科研工作者对辣椒素的探索。研究表明，辣椒素具有改善心肌重构、减轻动脉粥样硬化、改善胰岛素抵抗、降脂预防肥胖等作用[11-15]。为此笔者猜想辣椒素是否可以改善NAFLD肝细胞脂质的沉积，进一步为辣椒素在肥胖相关代谢性疾病中的运用提供理论依据。

通常情况下获得人肝脏细胞相对困难，且个体差异大，难于稳定的传代培养，因此研究脂代谢合适的体外肝细胞系是相当重要的。脂肪酸诱导LO2细胞的脂肪变是研究NAFLD的合适实验模型，同时油酸可以模拟高脂环境引起细胞内脂质沉积[16-19]。前期实验证明用40 μg/mL油酸为构建脂变肝细胞模型的最佳浓度，故本实验应用该浓度油酸刺激肝细胞株LO2，构建NAFLD细胞模型，采用100 μmo/L辣椒素作用于该细胞模型。本研究结果表明，油酸组的三酰甘油和油红O染色分别从定量和定性的角度证实40 μg/mL油酸诱导人正常肝细胞LO2发生了脂肪变；辣椒素组三酰甘油水平、脂滴明显少于油酸组，提示辣椒素可以有效抑制脂肪变肝细胞内三酰甘油的聚集。

细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖的降解产物再利用的过程，可在营养匮乏、电离辐射、氧化应激等情况下被诱导，它可将细胞质内损坏蛋白质、脂质、糖类及功能异常细胞器降解或去除，从而使细胞内环境得以维持稳态[20-23]。近年越来越多研究表明自噬参与细胞内脂质的调节[8,24]，在长期高脂饮食喂养的NAFLD动物模型中，肝细胞自噬受到损伤，由此说明自噬可以有效调节脂质在肝脏的代谢过程，对过度脂质沉积诱导的肝损害具有保护作用[25]。并且体外研究也证实自噬水平提高可以降低NAFLD细胞脂质沉积[6]。p62是一种多功能蛋白，作用于蛋白质降解酶体，可以促进错误或损伤蛋白质降解，在自噬过程中起到重要作用，细胞内p62的蓄积抑制自噬的发生。LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式，分别定位于前自噬体和自噬体膜表面，LC3-Ⅱ的水平或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值与自噬的数量呈正相关，一定范围内p62蛋白水平与自噬水平呈负相关[25-28]。因此p62的蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可作为自噬发生的标记。本研究观察到，p62和LC3在肝LO2细胞中具有一定基础水平表达，加入油酸(40 μg/mL)处理后，p62表达水平有所上升、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，说明脂肪变肝细胞模型中肝细胞自噬水平受到损伤，这也再次证实了自噬参与肝细胞脂质代谢过程[24-25]。这与Li等[6]在HepG2及小鼠构建的NAFLD的模型中研究结果一致。当脂肪变肝细胞LO2加入辣椒素其p62蛋白表达明显降低，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著高于油酸组，表明辣椒素可能通过上调脂肪变肝细胞自噬水平来减少肝细胞内脂质沉积。这与辣椒素能上调血管平滑肌细胞自噬表达，减少低密度氧化脂蛋白在血管平滑肌细胞中的沉积阻止了泡沫细胞的形成，具有异曲同工之处[7]。

综上所述，本实验利用油酸诱导LO2细胞株建立体外肝细胞脂肪变模型，辣椒素刺激NAFLD细胞，上调NAFLD细胞自噬水平，减少细胞内脂质沉积，但具体机制还需进一步研究。

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《重庆医学》编辑部

Effects of capsaicin on lipid metabolism of liver cells in vitro*

SunYu1,LiuJia2#,NingBo1,YangZhaoxia1△

(1.DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400010,China；2.DepartmentofGastroenterologyandHepatic,PurenHospitalofWuhanCity,Wuhan430081,China)

Objective To observe the effect of capsaicin on lipid deposition in liver cells and the expression of autophagy,to provide new ideas and targets for the study of fatty liver disease.Methods The model of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) was established by inducing LGF cell line of liver primary cells with oleic acid (40 μg/mL).The experiment was divided into blank control group,oleic acid group,capsaicin group[oleic acid+capsaicin(100 μmol/L)].The level of intracellular lipid was detected by oil red O staining and triglyceride (TG) kit.Western bolt was used to detect the expression level of autophagy marker molecule p62 and LC3,and to calculate the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ.Results After treated with 40 μg/mL oleic acid for 24 h,the oil red O staining showed that orange-red lipid droplets were found in the oleic acid group,but there was no obvious orange-red lipid droplet formation in the blank group,which suggesting that the NAFLD cell model was established successfully by using 40 μg/mL oleic acid in vitro.Oil red O staining was observed,the cells in the capsaicin group were significantly less than the oleic acid group,and the content of triglyceride in the liver cells was significantly lower than that in the oleic acid group(P<0.05).Western bolt test results showed that capsaicin group p62 protein levels were significantly lower compared with the oleic acid group(P<0.05),while the LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio was higher than that of oleic acid group(P<0.05).Conclusion NAFLD model was established by inactivating LO2 cell line with oleic acid in vitro.Capsaicin stimulated NAFLD cells,upregulated the autophagy level of NAFLD cells and reduced intracellular lipid deposition,but the specific mechanism need further study.

oleic acid;capsaicin;nonalcoholic fatty liver disease

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.003

国家自然科学青年科学基金(81000357)。 作者简介:孙玉(1989-)，在读硕士，主要从事非酒精性脂肪性肝病的研究。#并列第一作者：刘佳(1988-)，住院医师，主要从事非酒精性脂肪性肝病的研究。△

，E-mail：yangzhx2003@163.com。

R575.5

A

1671-8348(2017)11-1450-04

2016-10-21

2016-12-27)