B7-H1对脂多糖所致脓毒症小鼠T细胞增殖的影响

王 方

南阳医学高等专科学校基础部

B7-H1对脂多糖所致脓毒症小鼠T细胞增殖的影响

王 方

南阳医学高等专科学校基础部

目的观察B7-H 1对脂多糖所致脓毒症小鼠T细胞增殖的影响。方法脂多糖刺激小鼠树突状细胞造脓毒症免疫麻痹模型，使用光学显微镜、流式细胞术和BrdU细胞增殖反应试剂盒分别检测树突状细胞分化、B7-H 1表达水平及T淋巴细胞增殖反应的情况。结果脂多糖促进树突状细胞成熟，且B7-H 1表达平均荧光密度值由12.39增加到43.81，p＜0.001；然而T淋巴细胞反应抑制，OD值由0.761减少为0.374，并且封闭B7-H 1后反应活化，OD值由0.352增加到0.607，p＜0.001。结论免疫共抑制分子B7-H 1是脂多糖所致脓毒症小鼠T细胞增殖反应低下的主要诱因。

B7-H 1；脂多糖；脓毒症；树突状细胞

Fund project：Henan province basic and advanced technology research project plan pro ject（152300410018）and Nanyang science and techno logy attack plan p roject（2015KJGG18）.

1.前言

脓毒症（sepsis）是由感染和创伤等引起细菌等入侵诱发的全身炎性反应和组织器官继发性损伤的病理生理过程及临床症候群，病死率高，是重症监护病房（intensive care unit,ICU）难以攻克的医学难题之一[1]。脓毒症的发生与肠中血中脂多糖（lipopoiysaccharide,LPS）有密切关系[2]，并且免疫麻痹可能是参与脓毒症致病过程的主要因素之一。树突状细胞（dendritic cells,DCs）是最为强大的抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）[3]，DCs表面的B7H1（B7-homolog1）是程序性细胞死亡-1受体（programmed cell death 1,PD-1）的配体即PD-L1（programmed death-1-ligand 1），与活化T细胞受体PD-1结合后抑制T细胞反应，呈现“免疫麻痹”－一种低下的炎症反应[4]。本研究以LPS刺激DCs建立脓毒症免疫麻痹模型，探讨B7-H1在LPS所致DCs免疫麻痹中的作用，为临床上脓毒症所致免疫麻痹的治疗探寻潜在分子靶点。

2.资料与方法

2.1 主要试剂与动物rmGM-CSF和rm IL-4购自美国Peprotech公司。流式检测PE标记B7-H1抗体及同型对照抗体购自美国eBioscience公司。Real-time PCR试剂购自中国大连Tarkara公司。BrdU细胞增殖检测试剂盒购于美国Roche公司。C57BL∕6（H-2Kb）近交系小鼠，4-6周左右，雌性。购自中国科学院上海实验动物中心。

2.2 DCs的体外诱导和分组根据文献报道[4]培养板调整小鼠骨髓来源单核细胞密度约为1*106个∕ml，加入DCs专用培养基、rmGM-CSF和rm IL-4，4天后弃去悬浮细胞，得到未成熟DCs。实验组加入10ng∕ml LPS刺激12小时，对照组不加LPS。

2.3 DCs的分化和B7-H1表达检测按照2.2方法常规诱导，4天后换新鲜培养液，加LPS（10ng∕m l）刺激12小时，用光学显微镜观察DCs形态变化。收集计数细胞，冷PBS洗涤，B7-H1荧光抗体4℃避光孵育细胞30分钟，洗涤重悬细胞，上机检测。

2.4 T淋巴细胞增殖反应DCs负载抗原SIINFEKL（2μg∕m l），计数调整细胞浓度为5×105个∕100ul作为刺激细胞，其中B7-H1封闭抗体（10F.9G2）按0.5μg∕100ul，培养箱封闭约30分钟。无菌取C57BL∕6小鼠脾脏，研磨离心并裂解红细胞，调整为5×106个∕m l作为效应细胞。按刺激细胞：效应细胞=1：10总体积为200μl混合于96孔圆底板中，培养箱静置培养4天。按照BrdU细胞增殖检测试剂盒说明书流程操作读取OD值。

2.5 统计方法各组计量资料以均数（mean）±标准差（SD）表示。应用GraphPad Prism 5进行统计分析，组间均数采用t检验或单因素方差分析Newman-Keuls检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 脂多糖诱导树突状细胞成熟和T细胞免疫麻痹Fig-1.LPStreatmentcould augmentDCs’maturation and suppress T lymphocytesproliferation.（A.LPS促进DCs分化；B.LPS抑制T淋巴细胞活化增殖）（A.LPSpromoted DCs’polarization bymicroscopic imaging technique；B.LPS suppressed T lymphocytes proliferation by BrdU Cell Proliferation assay）

图2 脂多糖上调B7-H1抑制抗原特异性T细胞增殖Fig.2 LPStreatmentcould improve B7-H1 expression themolecularwhich played T lymphocytesproliferation suppression.（A-B.流式细胞术检测B7-H1表达百分比和平均荧光密度值；C.BrdU细胞增殖反应检测封闭B7-H1后抗原特异性T细胞增殖反应OD值）（A-B.B7-H1 positive percentageandmean fluorescent intensity valuewere detected by flowcytometry；C.T lymphocytesproliferationwith B7-H 1 blocking antibodywas detected by BrdU cell proliferation assay）

3.结果

3.1 脂多糖刺激DCs分化和T细胞增殖情况。显微镜观察显示：对照组DCs细胞呈半悬浮集落式生长，出现伪足和刺状突起。当加入LPS 12小时后，细胞重新贴壁，部分呈长梭形、条索状（见图1A）。T细胞增殖反应显示，OVA负载组、LPS刺激OVA负载组均能明显诱导淋巴细胞增殖反应，OD值分别为0.761，0.374。但LPS刺激OVA负载组的增殖反应水平（0.374）远低于OVA负载组（0.761），差异具有统计学意义（p＜0.001，单因素方差分析，见图1B），表明LPS刺激促进DCs的分化成熟但抑制T细胞活化增殖，建立脓毒症免疫麻痹模型。

3.2 脂多糖上调B7-H 1抑制T细胞增殖反应。流式细胞术检测显示LPS刺激后DCs表达B7-H1蛋白的阳性细胞百分比由对照组100%增加到147%，平均荧光密度值（MFI）由对照组12.49增加到43.48，具有显著差异（p＜0.001，t检验，见图2A-B）。BrdU细胞增殖反应结果显示，SIINFEKL负载组、LPS刺激SIINFEKL负载组和LPS刺激SIINFEKL负载并封闭B7-H1组均能明显诱导T淋巴细胞增殖反应，OD值分别为0.801，0.352，0.607。而LPS刺激SIINFEKL负载并封闭B7H1组的增殖反应水平（0.607）高于LPS刺激SIINFEKL负载组（0.352），差异具有统计学意义（p＜0.001，单因素方差分析，见图2C）。以上结果表明LPS刺激显著上调DCs共抑制分子B7H1抑制抗原特异性T细胞反应。

4.讨论

免疫麻痹是一种获得性免疫缺陷状态，涉及抗原提呈细胞、效应细胞、细胞因子、共刺激分子、调节性T细胞等免疫组分及整个网络的交互复杂作用过程。淋巴细胞亚群功能转换是感染后免疫麻痹的重要机制。本实验以脂多糖刺激小鼠树突状细胞造脓毒症免疫麻痹模型，发现LPS刺激高表达B7H1的DCs抑制T淋巴细胞反应水平，呈现免疫麻痹状态。免疫学研究也发现，在脓毒症病理条件下，DCs介导的免疫反应受到严重抑制。令人欣喜的是通过封闭抗体阻断B7H 1能够显著提高低下的T淋巴细胞反应水平。

LPS是细菌内毒素的主要成分，能刺激多种炎症介质释放，不仅能够通过TLR4促进DCs的成熟及T细胞的活化，而且可促进DCs介导的抗原交叉提呈。然而本研究发现LPS抑制DCs介导的T淋巴细胞反应引起免疫麻痹。对在细菌脓毒症的研究中也证实，细菌及其产物LPS通过TLR4-TRIF信号麻痹DCs抑制CTL反应。因此阻断TLR信号可以作为治疗脓毒症的有效方法之一。

B7-H1∕PD-1负性调控因子是近几年肿瘤免疫医药领域的研究热点。B7H1主要表达于小鼠DCs等免疫细胞上，与活化T细胞受体PD-1结合后，可通过诱导凋亡及阻止细胞周期而抑制T细胞反应，在T细胞增殖抑制、凋亡或失能中扮演重要角色。本研究发现LPS抑制DCs介导T淋巴细胞反应，呈现免疫麻痹，当使用B7H1封闭抗体阻断与T细胞的结合后，低下的T淋巴细胞反应水平升高。因此B7-H1可作为临床上脓毒症以及革兰氏阴性细菌感染所致免疫麻痹治疗的潜在分子靶点，以期改善患者预后。

[1]Hotchkiss RS,Coopersmith CM,McDunn JE,Ferguson TA. The sepsis seesaw：tilting toward immunosuppression[J].Nat.Med，2009；15：496-497.DOI：10.1038∕nm0509-496.

[2]Buras JA,Holzmann B,Sitkovsky M.Animalmodels of sepsis：setting the stage[J].Nat.Rev.Drug Discov，2005；4：854-865.DOI：10.1038∕nrd1854.

[3]Lin，M.L，Zhan，Y，Villadangos，J.A，and Lew，A.M.The cellbiology of cross-presentation and the role ofdendritic cellsubsets[J].Immunol.Cell Biol，2008；86：353-362.DOI：10.1038∕icb.2008.3.

[4]Wang，F，Wang，YY，Li J，etal.Increased Antigen Presentation but Impaired TCells Priming after Upregulation of Interferon-Beta Induced by Lipopolysaccharides Is Mediated by Upregulation of B7H1 and GITRL[J].PLOSONE，2014，9（8）：e105636.DOI：10.1371∕journal. pone.0105636.

河南省基础与前沿技术研究计划项目（编号：152300410018）和南阳市科技攻关计划项目（编号2015KJGG18）资助。