离子色谱-抑制电导、紫外串联检测肉类产品中的生物胺

朱作艺，张 玉，王君虹，黎天天，李 雪，王 伟*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 320021；2.农产品质量安全国家重点实验室省部共建培育基地，浙江 杭州 310021)

离子色谱-抑制电导、紫外串联检测肉类产品中的生物胺

朱作艺1,2，张 玉1,2，王君虹1,2，黎天天1，李 雪1,2，王 伟1,2*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 320021；2.农产品质量安全国家重点实验室省部共建培育基地，浙江 杭州 310021)

建立1种阳离子交换色谱分离，抑制型电导-紫外串联检测法测定肉类产品中腐胺、尸胺、组胺、亚精胺、苯乙胺、精胺、酪胺等7种生物胺的方法。样品经甲烷磺酸溶液提取，乙腈沉淀蛋白后，采用IonPac CG17 (50 mm×4 mm)保护柱和IonPac CS17 (250 mm×4 mm) 分析柱进行分离，采用甲基磺酸溶液作为淋洗液进行梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃。结果表明，在最佳色谱条件下，7种生物胺能达到较好的分离效果，在一定的浓度范围内，线性关系良好，线性相关系数均大于0.999 0，方法检出限在0.35～3.16 mg·kg-1，峰面积相对标准偏差均小于4.1% (n=6)。采用该方法对风干牛肉、小黄鱼及带鱼样品进行测定，样品加标回收率在88.2%～108.8%。该方法简单、方便，具有较好的重现性和准确性，适用于各肉类产品中多种生物胺的同时测定。

离子色谱； 生物胺； 抑制电导； 紫外； 肉类产品

生物胺是一类低分子量含氨基化合物的总称，可看作是氨分子上1～3个氢原子被烷基或芳香基所取代得到的物质。按化学结构来分类，生物胺可分为脂肪族(尸胺、腐胺、精胺、亚精胺等)、芳香族(酪胺、苯乙胺等)、杂环族(组胺、色胺等)等。也可将其分为单胺(酪胺、组胺、苯乙胺、色胺等)与多胺(腐胺、精胺、亚精胺等)。

食品中的生物胺主要来源于游离氨基酸在氨基酸脱羧酶作用下脱去羧基形成的产物。有文献报道称，部分生物胺是通过醛酮的胺化作用形成的[1-2]。生物胺广泛存在于富含氨基酸、蛋白质的水产品、肉制品和发酵制品中，如干酪、酒类、发酵香肠、调味品等[3-9]。通常腐败变质的食品中含高水平的生物胺。

生物胺作为生物体内正常的生理组分，适量的生物胺对维持机体正常生理功能具有重大意义。生物胺作为蛋白、核酸、激素的前体物质，与生物体中蛋白质、核酸、激素的合成有关；同时一定量的色胺、组胺、精胺、尸胺等在调节生长、增强代谢活力、控制血压、消除自由基等方面具有显著作用。但当人体摄入过量的生物胺时，会引起头疼、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重时可能危及生命[10]。生物胺中毒性最大的是组胺，毒性次之的酪胺则易引起偏头痛和高血压等不适反应。生物胺中的尸胺和腐胺虽然毒性较小，但是能抑制组胺和酪胺代谢酶的活性，从而增加组胺和酪胺的毒性。同时尸胺、腐胺、精胺、亚精胺等易与食品中的亚硝酸盐反应生成致癌性物质亚硝胺[11]。

生物胺分析检测方法包括分光光度法、荧光测定法、薄层层析法、高效液相色谱法、离子色谱法、气相色谱法和毛细管电泳法等[12]。分光光度法与荧光测定法只用于检测较受重视的生物胺，如组胺和酪胺。目前，色谱法是最常用的生物胺分析检测方法[13-17]。食品中生物胺的测定主要存在两方面的困难：1)样品基质复杂，一些含量水平低的生物胺易被样品中的其他组分干扰；2)生物胺分子量小，绝大多数生物胺本身既没有荧光特性，也没有特异的紫外吸收基团，因此多数检测方法如高效液相色谱法、气相色谱法需要对样品进行繁琐复杂的衍生化处理，同时还存在副产物的干扰。离子色谱是液相色谱的一种，可用于分析阴阳离子、极性及部分弱极性的有机化合物，具有分析速度快、灵敏度高、选择性好、样品用量少等特点。生物胺在酸性溶液中呈阳性，带正电荷，可用阳离子色谱柱进行分离。与高效液相法相比，离子色谱法检测生物胺不需要衍生过程，方法简单，减少了衍生化带来的干扰和衍生物不稳定等问题，从而使分析方法的稳定性和重现性得到提高。目前离子色谱法测定生物胺主要通过抑制电导检测，但仍有部分生物胺(如酪胺)利用电导无法检测。因此，本试验将抑制电导与紫外检测器串联，实现具有电导信号生物胺(腐胺、尸胺、组胺等)与无电导信号生物胺(酪胺)的同时检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Dionex ICS-3000离子色谱仪(美国戴安公司)，配有DP双泵(带脱气装置)，DC检测/色谱单元(双温控区)，EG淋洗液发生器单元；Chromeleon色谱工作站；Ultimate 3000系列VWD-3X00 UV-VIS检测器(美国戴安公司)；AS自动进样器(美国戴安公司)；Dionex IonPac CG17 (50 mm×4 mm)保护柱，Dionex IonPac CS17 (250 mm×4 mm)分析柱；Dionex CSRS 300-4 mm电化学自再生抑制器；超纯水系统；涡旋混匀器；离心机；0.22 μm尼龙滤膜过滤头。

99%甲基磺酸(MSA，阿拉丁试剂(上海)有限公司)；乙腈(色谱纯，Merck公司)；所有用水均为电阻率≥18.2 MΩ·cm-1去离子水。

标准品为酪胺(Tyramine)、腐胺(Putrescine)、尸胺(Cadaverine)、组胺(Histamine)、苯乙胺(Phenylethylamine)、亚精胺(Spermidine)和精胺(Spermine)，均购自上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 标准储备液配制

准确称取各生物胺标准样品，置于50 mL容量瓶中，用10 mmol·L-1的MSA定容至刻度，摇匀，分别配制成1 000 mg·L-1的生物胺标准储备液，于4 ℃下保存。

1.2.2 混合标准工作液配制

分别取适量的生物胺标准储备液，用10 mmol·L-1的MSA进行稀释，配制成一系列浓度的生物胺混合标准工作溶液。

1.2.3 淋洗液配制

MSA (100 mmol·L-1)。取6.5 mL的99% MSA，用去离子水定容到1 L。

1.3 色谱条件

色谱柱为Dionex Ionpac CG17保护柱(50 mm×4 mm)和Dionex Ionpac CS17分析柱(250 mm×4 mm)；流动相为MSA梯度淋洗液(程序见表1)；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；抑制电流103 mA；电导检测池温度35 ℃；紫外检测波长276 nm；进样量25 μL。

表1 淋洗液梯度程序

1.4 样品前处理

样品在匀浆机上彻底粉碎匀浆，取5 g待测样品，加入50 mL的10 mmol·L-1的MSA，超声提取30 min，冷冻离心机(温度4 ℃，8 500 r·min-1)离心10 min，取上清液5 mL，加5 mL乙腈涡旋混匀，离心后取上层液体4 mL用去离子水稀释到10 mL，混匀后过0.22 μm滤膜后进样上机。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

生物胺是一类碱性含氮化合物，存在于肉制品基体内部，因此需要对样品进行充分的粉碎和匀浆后用酸溶液提取，将提取液在高速离心机上离心后取上清液稀释。肉制品的上清液中含有大量的蛋白质大分子，根据离子色谱的特点，必须先沉淀蛋白质。由于乙腈的介电常数较小，沉淀蛋白质的效率相对较高，而强酸和中性盐的方法对样品本身的pH干扰较大，同时会带入其他干扰离子，因此用乙腈作为蛋白质沉淀剂，操作方便，沉淀效果好。

2.2 流动相选择和梯度的优化

本试验采用Dionex Ionpac CS17弱阳离子交换色谱柱，MSA作为淋洗液，在酸性流动相条件下，不同种类的生物胺根据所带电荷的差异、离子半径的大小以及极化程度的不同进行分离。在CS17阳离子交换色谱柱上，初始设置淋洗液浓度为等度的12 mmol·L-1的MSA，尸胺和腐胺之间没有达到基线分离，组胺保留时间及与其他组分之间的分离效果较好，而亚精胺、苯乙胺、精胺等保留时间过长，因此对淋洗液的条件进行了梯度优化，将初始淋洗液浓度降到10 mmol·L-1的MSA，腐胺与尸胺在低浓度淋洗液条件下能达到较好的分离，在12 min后增加淋洗液浓度进行梯度洗脱，按照表1中的甲烷磺酸淋洗液梯度条件能够同时对7种生物胺进行较好地分离(标准色谱图见图1)。由于酪胺经过抑制后缺少电荷，无电导信号，而通过紫外检测具有良好的信号，从而可实现酪胺与其他生物胺的同时测定。

A为抑制电导检测；B为紫外检测；1为腐胺，2为尸胺，3为组胺，4为亚精胺，5为苯乙胺，6为精胺，7为酪胺，图2同图1 生物胺的标准色谱

从图1中可以看出，其中个别生物胺(苯乙胺)的峰较宽，主要原因是生物胺结构中均含有苯环或杂环等结构，而离子交换树脂的基体是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，这些结构与色谱柱的基体具有相似相溶性，从而导致峰宽较宽。

2.3 方法的线性范围及检出限

为了考察分析方法的线性关系及检出限，将7种生物胺标准品用10 mmol·L-1的MSA稀释得到一系列浓度，按照色谱条件1.3节对上述系列浓度进行测定。以峰面积为纵坐标、标准液质量浓度为横坐标建立标准工作曲线，其线性范围、相关系数r和检出限(信噪比S/N=3)等如表2所示。被测组分的峰面积与进样浓度呈良好线性关系，且线性范围宽，检测限较低，适于样品中低含量生物胺检测分析。

2.4 方法的重现性

通过对同一标准工作溶液按1.3节色谱条件平行分析6次考察方法的重复性，其中7种生物胺标准溶液质量浓度为10.0 mg·L-1。试验结果表明，7种生物胺的峰面积的相对标准偏差(RSD)小于4.1%(表2)，说明该方法具有良好的重现性。

表2 生物胺线性关系、检出限及重现性

生物胺线性范围/(mg·L-1)相关系数方法检出限/(mg·kg-1)峰面积RSD/%腐胺0.1～1000.99900.351.8尸胺0.1～1000.99980.431.2组胺0.2～1000.99961.092.5亚精胺0.1～1000.99960.392.9苯乙胺0.5～1000.99991.763.6精胺0.1～1000.99910.562.6酪胺0.5～1000.99983.164.1

2.5 样品测定及加标回收率

按照1.4节样品前处理和1.3节色谱条件对风干牛肉、冰鲜小黄鱼及带鱼样品进行测定，外标法定量，其中风干牛肉样品及加标色谱图如图2所示。通过在样品中加入一定浓度的混合生物胺标准品，平行测定3次，加标回收率结果见表3，加标回收率在88.2%～108.8%，RSD均小于4.8%，表明该方法符合样品分析的要求。

3 小结

综上所述，本方法采用阳离子交换分离，抑制型电导检测测定了肉类样品中的腐胺、尸胺、组胺、亚精胺、苯乙胺以及精胺，同时将电导检测器与紫外检测器串联，紫外作为电导检测的补充，实现了多种生物胺与无电导信号的酪胺的同时检测。该方法简单、方便，通过方法学验证，线性范围宽，线性关系良好，方法具有较好的重现性和准确度。该方法避免了其他色谱法复杂和烦冗的衍生过程，又可实现多种生物胺的同时检测，适用于一系列复杂样品基体中生物胺的测定。

图2 风干牛肉样品(a)及加标(b)色谱图

生物胺风干牛肉小黄鱼带鱼测定量/(mg·kg-1)加标回收率/%RSD/%测定量/(mg·kg-1)加标回收率/%RSD/%测定量/(mg·kg-1)加标回收率/%RSD/%腐胺37.2101.44.89.593.62.14.292.33.3尸胺10.0105.91.314.994.71.93.691.52.6组胺12.496.70.4-98.31.1-94.90.9亚精胺15.9108.80.95.2102.41.84.898.32.3苯乙胺-91.63.2-88.23.6-90.44.0精胺66.9101.32.013.6103.52.56.8105.72.2酪胺39.898.90.911.898.21.4-96.52.7

[1] SANTOS M H S. Biogenic amines：Their importance in foods [J]. International Journal of Food Microbiology，1996，29：213-231.

[2] TENBRINK B，DAMINK C，JOOSTEN H M L J，et al. Occurrence and formation of biologically-active amines in foods [J]. International Journal of Food Microbiology，1990，11：73-84.

[3] MORET S，SMELA D，POPULIN T，et al. A survey on free biogenic amine content of fresh and preserved vegetables [J]. Food Chemistry，2005，89：355-361.

[4] VALENTE I M，SANTOS C M，GONCALVES L M，et al. Application of gas-diffusion microextraction for high-performance liquid chromatographic analysis of aliphatic amines in fermented beverages [J]. Analytical Methods-UK，2012，4：2569-2573.

[5] SUZZI G，GARDINI F. Biogenic amines in dry fermented sausages：a review [J]. International Journal of Food Microbiology，2003，88：41-54.

[6] SAMKOVA E，DADAKOVA E，PELIKANOVA T. Changes in biogenic amine and polyamine contents in smear-ripened cheeses during storage [J]. European Food Research and Technology，2013，237：309-314.

[7] KIM M K，MAH J H，HWANG H J. Biogenic amine formation and bacterial contribution in fish，squid and shellfish [J]. Food Chemistry，2009，116：87-95.

[8] KIM B，BYUN B Y，MAH J H. Biogenic amine formation and bacterial contribution in Natto products [J]. Food Chemistry，2012，135：2005-2011.

[9] ZHAI H L，YANG X Q，LI L H，et al. Biogenic amines in commercial fish and fish products sold in southern China [J]. Food Control，2012，25：303-308.

[10] ANLI R E，BAYRAM M. Biogenic Amines in Wines [J].Food Rev Int，2009,25(1)：86-102.

[11] SHALABY A R. Significance of biogenic amines to food safety and human health [J]. Food Research International，1996，29：675-690.

[12] ONAL A. A review：Current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods [J]. Food Chemistry，2007，103：1475-1486.

[13] REDRUELLO B，LADERO V，CUESTA I，et al. A fast，reliable，ultra high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of amino acids，biogenic amines and ammonium ions in cheese，using diethyl ethoxymethylenemalonate as a derivatising agent [J]. Food Chemistry，2013，139：1029-1035.

[14] Wang Y Q，Ye D Q，Zhu B Q，et al. Rapid HPLC analysis of amino acids and biogenic amines in wines during fermentation and evaluation of matrix effect [J]. Food Chemistry，2014，163：6-15.

[15] DAM D V，VERMEIREN Y，AERTS T，et al. Novel and sensitive reversed-phase high-pressure liquid chromatography method with electrochemical detection for the simultaneous and fast determination of eight biogenic amines and metabolites in human brain tissue [J]. Journal of Chromatography A，2014，1353：28-39.

[16] RAMOS R M，VALENTE I M，RODRIGUES J A. Analysis of biogenic amines in wines by salting-out assisted liquid-liquid extraction and high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection [J]. Talanta，2014，124：146-151.

[17] FAVARO G，PASTORE P，SACCANI G，et al. Determination of biogenic amines in fresh and processed meat by ion chromatography and integrated pulsed amperometric detection on Au electrode [J]. Food Chemistry，2007，105：1652-1658.

(责任编辑：张瑞麟)

2016-12-25

浙江省自然科学基金(LQ15C200006，LY15C200010)；国家自然科学基金(31401495)；浙江省农业科学院青年人才培养项目

朱作艺(1987—)，女，助理研究员，研究方向为食品质量与安全，E-mail: zhuzuoyi2008@126.com。

王 伟，E-mail: wangwei5228345@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170407

TS251

B

0528-9017(2017)04-0572-05

文献著录格式：朱作艺，张玉，王君虹，等. 离子色谱-抑制电导、紫外串联检测肉类产品中的生物胺[J].浙江农业科学，2017，58(4)：572-576.