MTT法和CCK-8法检测中药抗病毒活性成分细胞毒性的比较

蔡文涛(1.湖北大学中药生物技术湖北省重点实验室，湖北 武汉，430062；2.湖北省生物资源绿色协同创新中心(湖北大学)，湖北 武汉，430062；3.湖北大学生命科学学院，湖北 武汉，430062)



MTT法和CCK-8法检测中药抗病毒活性成分细胞毒性的比较

蔡文涛
(1.湖北大学中药生物技术湖北省重点实验室，湖北 武汉，430062；2.湖北省生物资源绿色协同创新中心(湖北大学)，湖北 武汉，430062；3.湖北大学生命科学学院，湖北 武汉，430062)

0 引言

中药是大自然赐予人类的无价瑰宝，对人类防治疾病，强身健体具有宝贵的利用价值. 从中药中发掘天然抗病毒活性成分，是开发抗病毒药物的重要途径.穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分，是传统中药材之一.其主要药效成分是二萜内酯类化合物，如穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯.现代药理学研究表明，穿心莲具有消炎解热、镇痛、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、免疫刺激、保肝利胆等功效.在抗病毒作用方面，穿心莲表现出对丙肝病毒(HCV)[1]、人类免疫缺陷病毒(HIV)[2]、流感病毒(IV)[3]等均具有一定抑制效果.进行穿心莲中抗病毒成分的筛选将为后续深入研究其抗病毒的作用及机制提供科学依据.开展中药成分抗病毒活性筛选及研究，需要进行体内和体外实验，而且首先要进行中药成分的毒性研究. 体内实验通常选择动物作为模型，由于动物实验费时、成本高，难以开展大量中药成分的毒性检测及抗病毒活性筛选. 实际情况下，常先进行体外实验，选择细胞模型，进行中药成分毒性的测定及其抗病毒活性的初筛.

检测药物在细胞上的毒性，通常采用的方法是测定药物加入后细胞的存活与增殖情况. 其中，比较经典的方法有四甲基偶氮唑盐(MTT)法[4-5]. 自1983年Mosmann建立MTT比色法以来，由于其简单、经济、无放射性污染等特点，MTT法已经成为细胞生物学领域测定细胞生长及增殖情况的常用方法. 但是由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测. 这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者的健康也有损害. 为了克服MTT法检测的不足之处，近些年又陆续出现一些新的检测方法，如MTS[6]，WST-1[7]，XTT[8]，Cell Counting Kit(CCK-8)法[9]等. 其中CCK-8法是应用得相对比较广泛的方法之一[10-11]. CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法. CCK-8试剂被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，可直接进行测定，实验误差比较小.

本文中将MTT法和CCK-8法同时应用于检测穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等具有潜在抗病毒作用的中药成分的细胞毒性研究中. 实验中选择的是A549人肺腺癌细胞株. 从实验的测定条件、结果的重复性及准确性等方面，比较两种方法的优缺点.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 A549细胞(购于美国菌种保藏中心)用加100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素溶液的含10% 胎牛血清(FBS，购于GIBCO公司)的F12培养基(HyClone公司)培养.

1.1.2 药品 脱水穿心莲内酯(14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide)和穿心莲内酯(andrographolide)均购于中国药品检验所，纯度>99.99%. 药品用二甲亚砜(DMSO，购于美国Sigma公司)配制为浓度为20 mg/mL的储备液，临用前用无血清的细胞培养基稀释成所需浓度.

1.1.3 试剂及试剂盒 MTT(购于美国Sigma公司)溶解(超声促溶)于20 mL灭菌的 PBS溶液中，经0.22 μm孔径滤器过滤除菌后，4 ℃避光保存备用.CCK-8试剂盒购于Dojindo Molecular Technologies公司.

1.1.4 仪器 超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)，HEAR Cell CO2培养箱(德国Heraeus公司)，Bio-Rad多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司)，Olympus IX 70倒置显微镜(日本Tokyo公司).

1.2 方法

1.2.1 实验原理 MTT法是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性黄色可溶性 MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能. DMSO能溶解细胞中的甲瓒结晶，用酶标仪在490 nm波长处测定其吸光度值(Optical density,OD值).

CCK-8法是利用含有WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性、能溶解于组织培养基中的橙黄色甲瓒染料. 用酶标仪在450 nm波长处测定其OD值.

在一定细胞数范围内，两种方法中生成的甲瓒量均与活细胞数量成正比. 测定的OD值越大，表明活细胞数越多. 通过OD值的测定，可以准确反映实验板各孔中活细胞的相对量. 加入药物作用的孔中活细胞数量与加入溶剂处理的孔中活细胞数量进行比较，可以间接衡量药物的细胞毒性情况.

在MTT法中，接下来向每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)和80 μL无血清培养基，培养4 h. 终止培养，小心吸去孔内培养液. 每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解. 用酶标仪测定各孔在490 nm的吸光度(OD)值. 实验中同时设立正常细胞对照(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT和DMSO)和空白对照(无细胞、加培养基、MTT和DMSO).

在CCK-8法中，接下来向每孔加入10 μL CCK-8试剂和90 μL无血清培养基，培养30 min. 用酶标仪测定各孔在450 nm的OD值. 实验中同时设立正常细胞对照(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液和CCK-8)和空白对照(无细胞、加培养基和CCK-8).

利用公式计算细胞存活率：Cell viability /%=(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白) ×100，并利用改良寇式法计算CC50(The median cytotoxic concentration，中位浓度即对50%的细胞产生细胞毒性时对应的药物浓度).

1.2.3 统计学分析 应用GraphPad Prism 5软件及改良寇式方法进行数据的处理及统计分析. 所得结果用平均值(x)±标准偏差(SD)表示，采用Student’st-test进行两组均数比较.

2 结果与分析

表1 不同浓度化合物对A549细胞存活率的影响

用Student’s t-test进行统计学显著性分析.*, **, ***分别表示与空白对照比较p<0.05,p<0.01,p<0.001;#,##,###分别表示与相同浓度MTT法测定结果比较p<0.05,p<0.01,p<0.001.

图1 MTT法和CCK-8法检测穿心莲内酯毒性时A549细胞形

图2 MTT法和CCK-8法检测脱水穿心莲内酯毒性时A549细胞形

2.3 两种不同方法检测的精密度比较 分别用MTT法和CCK-8法检测穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯作用于A549细胞的存活率，计算得到CC50.用3次重复实验的CC50结果计算变异系数(coefficient of variation,CV)，比较两种方法的精密度，结果见表2.用MTT法检测穿心莲内酯的CC50时，3次结果的CV为9.44%，而相应地用CCK-8法检测时，CV为2.51%.这说明用CCK-8法检测CC50的离散程度较小，方法的精密度较MTT法更高.同样，可以比较用MTT法和CCK-8法检测脱水穿心莲内酯CC50的CV，前者为7.51%，后者为1.52%，也说明CCK-8法检测CC50的精密度较MTT法更高.

表2 两种方法测定的CC50值的CV比较

2.4 两种不同方法检测穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的毒性比较 由表3可知，用MTT法和CCK-8法检测得到的穿心莲内酯的CC50分别为22.51和12.17 μg/mL，结果之间存在一定差异；另外，应用GraphPad Prism 5软件拟合y(OD值)与化合物的浓度x(μg/mL)的关系得到非线性的回归方程，拟合优度的判定系数(RNew)分别为：0.989 1和0.992 8.另外，表1中CCK-8法测定得到的不同浓度下细胞存活率数据的标准偏差(SD)比对应浓度下MTT法测定得到数据的SD小.综上，说明CCK-8法测定的误差小，该方法的准确度相对MTT法更高.

用MTT法和CCK-8法检测得到的脱水穿心莲内酯的CC50分别为21.40和19.84 μg/mL，结果之间比较接近；另外，应用GraphPad Prism 5软件拟合y(OD值)与化合物的浓度x(μg/mL)的关系得到非线性的回归方程，拟合优度的判定系数(RNew)分别为：0.987 8和0.997 1.同上进行细胞存活率数据的SD值的比较，也可得出CCK-8法测定的准确度更高的结论.

表3 两种方法检测穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯毒性的比较

用 Student’st-test进行统计学显著性分析.**和ns分别表示与MTT法测定结果比较有极显著性差异(p<0.01)和无显著性差异.

3 讨论

目前，已有报道认为CCK-8法是相对MTT法更为简便、快捷且应用成熟的细胞增殖-毒性检测的方法.如侯春梅等在悬浮细胞的增殖检测实验中发现CCK-8法重复性好、灵敏度高，明显优于MTT法[12].在应用MTT和CCK-8法检测5-氟尿嘧啶和奥沙利铂在WiDr、SW620和HT-29等3种癌细胞株中的抗增殖研究中也发现CCK-8法是更灵敏的检测方法[13].

综合本文中的研究结果，我们发现CCK-8法相对MTT法而言，精密度和准确度均更高，操作更为简便和快速，对实验者和环境危害低，值得在细胞增殖和药物毒性检测等实验中推广应用.

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[3] Cai W T, Li Y T, Chen S R, et al. 14-Deoxy-11,12-dehydroandrographolide exerts anti-influenza A virus activity and inhibits replication of H5N1 virus by restraining nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes[J]. Antiviral Res, 2015, 118:82-92.

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(责任编辑 游俊)

The comparision of MTT and CCK-8 by detecting cytotoxicity ofantiviral active components in traditional Chinese medicine

CAI Wentao

(1.Hubei Province Key Laboratory of Biotechnology of Chinese Traditional Medicine(Hubei University), Wuhan 430062, China；2.Hubei Collaborative Innovation Centre for Green Transformation of Bio-Resources(Hubei University), Wuhan 430062, China；3.College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, China)

To investigate the cytotoxicity in vitro is the first step of screening the antiviral active of traditional Chinese medicine(TCM). In our study, MTT and CCK-8 were used to test the cytotoxicity of two promising antiviral components in a TCM namedAndrographispaniculata, andrographolide and 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide in human lung epithelial A549 cell line. Cell viabilities from the two methods were identical that non-toxic concentrations of andrographolide and 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide were 0—5 μg/mL and 0—10 μg/mL, respectively. Coefficient of variation(CV) ofCC50of andrographolide and 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide by MTT were both higher than that by CCK-8, which suggested that precision of CCK-8 was higher than MTT. Determination coefficients of goodness of fit in regression equation and standard deviation of cell viability indicated that accuracy of CCK-8 was also higher than MTT. Furthermore, CCK-8 was easier and faster in manipulation and less dangerous to experimenter and environment, which was worthy applying in the test of cellular proliferation and toxicity of medicine.Key words：MTT; CCK-8; cytotoxicity; antiviral component

2016-12-18

湖北大学自然科学基金(170041)资助

蔡文涛(1980-)，女，讲师， E-mail: yetar@163.com

1000-2375(2017)03-0305-06

R966

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2017.03.016