高血糖对大鼠丝状乳头、菌状乳头及味蕾的影响

刘彩云，龙明生，董红，孟杨

(1.湖北医药学院附属东风口腔医院口腔内科，湖北十堰442000；. 2.武汉大学医学院口腔解剖生理学教研室，湖北武汉430071)

·论著·

高血糖对大鼠丝状乳头、菌状乳头及味蕾的影响

刘彩云1，龙明生1，董红1，孟杨2

(1.湖北医药学院附属东风口腔医院口腔内科，湖北十堰442000；. 2.武汉大学医学院口腔解剖生理学教研室，湖北武汉430071)

目的探讨高血糖对丝状乳头、菌状乳头及味觉感受器的影响，为临床糖尿患者味觉功能紊乱的诊断、评估与治疗提供形态学资料。方法30只健康雄性SD大鼠按体质量随机分为正常对照组(n=14)和糖尿病组(n=16)。以链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg一次性腹腔注射建立1型糖尿病模型。普通饲料喂养12周后取舌组织，以亚甲蓝染色光镜下观察两组大鼠舌菌状乳头数目以及类型。采用HE染色并在光镜下观察两组大鼠菌状乳头、味蕾的组织学变化。采用Phtoshop软件测量味蕾的大小、面积，并以SPSS15.0统计软件进行数据分析。结果与对照组比较，糖尿病组大鼠味蕾数目减少、味蕾面积显著缩小(P＜0.01)，但两组间乳头总数差异无统计学意义(P＞0.05)；对照组大鼠菌状乳头91.1%为有孔菌状乳头，8.9%为无孔菌状乳头，未发现丝状样变的菌状乳头；与对照组比较，糖尿病组大鼠有孔菌状乳头数仅占59.1%，无孔菌状乳头数目显著增多，差异有显著统计学意义(P＜0.01)，并且出现丝状样变的菌状乳头。结论1型糖尿病大鼠味觉感受器表现出一系列萎缩的形态学改变特征；菌状乳头味蕾的面积与味觉敏感性相关。

糖尿病；菌状乳头；味蕾；味觉

味觉是对动物至关重要的特殊感觉功能，味觉的感受器是味蕾，味蕾是由60～100个味蕾细胞构成的卵圆形小体。在哺乳动物中，味蕾主要分布于菌状乳头、叶状乳头和轮廓乳头的上皮内，而丝状乳头不具有味觉功能[1]。味觉系统构成一个额外的内分泌调控位点，影响食物摄入，进而调节机体能量平衡[2]。许多因素如年龄、温度及疾病均可对味觉产生明显的影响。随着社会发展，人们饮食结构和生活方式的改变，糖尿病在世界范围发病率逐年上升，而我国糖尿病患者数量位居全球首位，严重危害人民健康[3]。糖尿病主要危害为其各种并发症，味觉损害正是其中之一。糖尿病患者的甜、咸等味觉敏感性显著低于健康人群，严重影响其生活质量，并因此可能导致其摄入较多的糖、盐及调味品等从而不利于糖尿病患者的饮食控制。以往对糖尿病与味觉关系的研究多局限于味觉阈和敏感性方面，但糖尿病对味觉感受器形态、功能方面的影响方面的研究仍然少有报道。本研究建立了糖尿病大鼠模型并对高血糖对丝状乳头、菌状乳头及味觉感受器的形态学影响进行了研究，以期为临床糖尿患者味觉功能紊乱的诊断、评估与治疗提供形态学方面的基础资料。

1 材料与方法

1.1 糖尿病大鼠模型建立SPF级成年雄性SD大鼠30只(武汉大学医学院实验动物中心提供)，体质量210～260 g。将大鼠按体质量随机分为对照组(n= 14)和造模组(n=16)。大鼠禁食24 h，造模组一次性腹腔注射1%STZ-柠檬酸盐缓冲液，剂量为60 mg/kg(注射前取-20℃保存的粉剂STZ，以0.1 mmol/L，pH值为4.2的枸橼酸缓冲液配制)。对照组腹腔注射等量的柠檬酸盐缓冲液。注射后48 h并禁食4 h后尾静脉取血，检测血糖(SureStep血糖仪)，以空腹血糖大于16.7 mmol/L，尿糖3+～4+，出现多饮、多食、多尿等表现并维持一周以上者确定为糖尿病模型建立并作为糖尿病组。模型建立后每周称量体质量，测定空腹血糖并排除不符合标准的实验对象(糖尿病组1只造模不成功，中途死亡2只，故糖尿病组纳入研究对象13只，对照组14只)。

1.2 标本制备普通饲料喂养，自由进食进水，喂养12周。处死前禁食12 h，自由饮水并称取体质量，断尾取血并测定血糖。注射过量的戊巴比妥钠以深麻醉致死大鼠，快速取出舌组织并制备组织切片，分别以亚甲蓝及HE进行染色。

1.3 光镜观察以光学显微镜下观察舌组织亚甲蓝染色切片，比较两组大鼠舌菌状乳头、味蕾的形态学变化，并对菌状乳头、味孔进行计数。观察舌组织HE染色切片，比较两组大鼠舌菌状乳头、味蕾的形态学变化。

1.4 图形分析光镜下对菌状乳头味蕾的连续纵切面进行拍照，取味蕾面积最大者以Photoshop软件测量味蕾长轴、短轴。因菌状乳头的味蕾纵切面近似椭圆形，故采用公式“截面积=π×长半轴×短半轴”(π为圆周率)计算味蕾面积。

1.5 统计学方法在同等放大倍数下，随机选择20个观测值用SPSS15.0统计分析软件进行数据处理。本实验中的计量数据均以均数±标准差()表示，对相关数据之间的差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠状态及体质量、血糖情况对照组SD大鼠摄食、饮水情况、精神状态及日常活动均正常，体质量逐渐增加。糖尿病组大鼠在STZ注射后一周内即出现多尿、多饮、多食症状，体质量自第2周开始较正常组有所下降。如表1所示，至第12周时，糖尿病组大鼠体质量较正常组明显下降(P＜0.01)。糖尿病组大鼠血糖较正常组明显升高，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。

表1 两组大鼠血糖、体质量测量结果()

表1 两组大鼠血糖、体质量测量结果()

组别例数实验前血糖(mmol/L)实验后血糖(mmol/L)实验前体质量(g)实验后体质量(g对照组糖尿病组t值P值14 13 4.1±0.3 4.2±0.1 1.143 0.264 4.2±0.4 25.7±1.6 48.733＜0.01 236.8±9.2 239.4±8.4 0.765 0.451 ) 443.2±7.3 206.1±6.2 90.565＜0.01

2.2 大鼠舌乳头形态结构改变

2.2.1 亚甲蓝染色正常对照组SD大鼠在舌背表面数量较多，呈圆锥状的为丝状乳头。菌状乳头散在于丝状乳头之间，数量较少、体积较大、顶部呈凸向上的近似半圆形，着色较浅(图1A)。在菌状乳头的顶部中央着色较深，该处即为味孔区域(图1B)。光镜观察发现对照组大鼠菌状乳头有两种形态，即有孔菌状乳头和无孔菌状乳头，其中有孔菌状乳头比例高达91.1%。与对照组比较，糖尿病组菌状乳头呈现三种形态：有孔菌状乳头、无孔菌状乳头和丝状样变的菌状乳头(图1C、1D)。如表2所示，其中有孔菌状乳头数量仅占59.1%，显著减少；无孔菌状乳头达34.9%，显著增多；而且还出现了少量丝状样变的菌状乳头。

表2 两组大鼠菌状乳头的类型和数目比较(，个)

表2 两组大鼠菌状乳头的类型和数目比较(，个)

注：FF：菌状乳头。

组别例数有孔FF 无孔FF 丝样变FF FF总数对照组糖尿病组t值P值14 13 76.58±1.20 47.34±2.31 41.721＜0.001 7.46±0.35 27.93±1.01 71.445＜0.001 0 4.70±0.20 88.065＜0.001 84.04±0.60 79.97±2.03 1.967 0.061

2.2.2 HE染色正常对照组大鼠菌状乳头呈蘑菇状，乳头表面为较薄的角化上皮，乳头结缔组织内毛细血管较丰富，乳头顶部上皮内可见味蕾(图2A)。与对照组比较，糖尿病组观察到3种形态的菌状乳头。(1)有孔菌状乳头：菌状乳头内含有味蕾及味孔，但菌状乳头表面角化层明显增厚，结缔组织内毛细血管减少，味蕾体积缩小(图2B)。(2)无孔菌状乳头：菌状乳头内未见味蕾及味孔，菌状乳头表面角化层增厚，固有层内未见初级乳头(图2C)。(3)丝状样改变菌状乳头：菌状乳头呈尖锥状隆起，角化层明显增厚(图2D)。正常组丝状乳头排列有序，统一向舌根方向倾斜(图3A)，糖尿病组丝状乳头排列较杂乱(图3B)。比较两组大鼠味蕾面积，对照组大鼠味蕾约(551.32±18.30)μm2，糖尿病组味蕾面积缩小至(265.67±13.24)μm2，差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 大鼠舌乳头亚甲蓝染色

图2 大鼠舌菌状乳头HE染色

图3 大鼠舌丝状乳头HE染色

3 讨论

根据国际糖尿病联盟的数据，中国糖尿病患者总数近1.1亿，已成为全球糖尿病发病的第一大国；且患者仍迅速增加，至2040年预计将达到1.5亿，仍居世界首位。糖尿病已经成为我国人民健康造的重大威胁。糖尿病的危害主要在于其多种并发症。味觉损害也是糖尿病的重要并发症之一，并长期遭到忽视。Floch等[4]用电味觉和化学测定两种方法研究了糖尿病对患者味觉的影响，结果显示糖尿病患者甜、苦、咸、酸四种基本味觉均有减退，有73%的患者味觉受损，而健康人仅为16%，结果还提示味觉损害与糖尿病导致的周围神经病变相关。味觉损害严重影响糖尿病患者生活质量，特别是由于味觉退化，患者较之健康人群倾向于更多地摄取盐、糖及各类调味品，不利于糖尿病饮食控制，长此以往将加重糖尿病病情。然而，糖尿病引起的味觉损害尚未引起足够重视，而当味觉功能减退时，国内外目前尚无有效的治疗方法。因此，对糖尿病导致味觉损害的机制进行研究对临床糖尿患者味觉功能紊乱的诊断、评估与早期预防均有重要的意义。

味蕾是味觉的化学感受器，味蕾顶端的味孔和伸入味孔的味毛是味觉产生的起始部位。味物质通过味孔与味细胞顶端微绒毛上的味受体或离子通道受体结合，进而将化学刺激信号传递至胞内，随后味细胞去极化并向与之相连的味觉传入神经释放神经递质并引发神经元兴奋，产生的电信号传入大脑并最终引起味觉。可见，味蕾在味觉产生中扮演着至关重要的角色。味蕾的分化、发育及正常形态的维持有赖于味觉神经的支配及营养作用[5]。当神经纤维损伤或切断时，其支配的味蕾随之减少甚至消失，而神经重新分布支配时，味蕾再生[6]。哺乳动物的味蕾绝大部分分布于味乳头尤其是菌状乳头中，味蕾的数量、大小及功能取决于味乳头的健康状态。有国外研究表明感觉神经纤维在味乳头特别是菌状乳头的形成与发育中起着重要作用[7]。在仓鼠上进行的单侧鼓索神经切断试验表明[8]：失去鼓索神经支配的菌状乳头上味蕾味孔直径变小，味小管管径变窄。Sollars等[9]也研究发现：新生大鼠切除单侧鼓索神经后该侧菌状乳头数量减少，味蕾体积缩小，发育受到严重影响，提示菌状乳头和味蕾的正常发育高度依赖神经支配。

糖尿病导致的神经病变可累及人体神经系统的各个部分，且感觉神经受损早于运动神经，相当一部分患者在糖尿病早期乃至糖耐量受损期就出现了可经肌电图证实的感觉神经传导速度减慢。研究表明：糖尿病周围神经病变患者常合并味觉功能减退[10]。本研究发现：糖尿病组大鼠有孔菌状乳头明显减少且菌状乳头味孔密度显著降低，反之无孔菌状乳头、丝状样变的菌状乳头显著增多，菌状乳头顶部变窄，初级乳头消失，丝状乳头也出现了萎缩等现象；味蕾面积显著缩小，部分菌状乳头内味蕾消失。与正常对照组相比，糖尿病组菌状乳头角化层明显增厚，固有层内未见明显初级乳头，味蕾的高度降低，面积显著缩小。随着菌状乳头及味蕾、味孔的密度降低，味觉化学感受器减少，这直接影响味物质与味细胞、味受体的结合，进而导致味觉功能受损。Patricio等[11]研究发现：糖尿病患者味觉损害可能与味乳头密度减少有关，本研究结果进一步证实了上述发现。味乳头及味蕾正常形态和功能的维持高度依赖味觉神经纤维，据此我们进一步推测糖尿病组大鼠味蕾及味乳头的改变可能与糖尿病导致的味觉神经纤维受损有关，这也为糖尿病患者味觉损害机制研究及防治提供了新的思路。

Schiffman等[12]提出：“味觉是人的大问题和难题，我们可以矫正视力，改善听力，但是很难恢复我们的味觉”。味觉损害是糖尿病的早期并发症之一，且与神经损伤密切相关。本研究探讨了高血糖对菌状乳头、丝状乳头及味蕾的影响，为糖尿病导致的味觉损害机制研究和临床味觉功能紊乱症的早期诊断与治疗以及糖尿病神经损害的早期预警提供了形态学资料。但其具体机制及与糖尿病导致的神经损害间的相互关系仍不明确，有待进一步研究。

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Impact of hyperglycemia on filiform papillae,fungiform papillae and taste buds in rats.

LIU Cai-yun1,LONG Ming-sheng1,DONG Hong1,MENG Yang2.1.Department of Oral Medicine,Dongfeng Stomatology Hospital，Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA;2.Department of Oral Anatomy and Physiology,School of Medicine, Wuhan University,Wuhan 430071,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the impact of hyperglycemia on the filiform papillae,the fungiform papillae and taste buds in rats,so as to provide morphological data for diagnosis,assessment and treatment of diabetics with taste dysfunction.MethodsThirty healthy male SD rats were randomly divided into control group(n=14)and diabetic group(n=16)according to weight.Type 1 diabetic rats were induced by a single intraperitoneal injection streptozotocin (60 mg/kg).And then rats were fed on regular chow diet for 12 weeks.The tongue tissues were removed after 12 weeks. The number and shapes of fungiform papillae were observed by methylene blue staining and light microscopy.The morphological alterations of fungiform papillae and taste buds were observed by HE staining.Phtoshop software was used to measure the size and area of taste buds.The results were analyzed by the SPSS15.0 statistical software.ResultsCompared with normal controls，the number and area of taste buds in diabetic rats decreased significantly(P＜0.01).However，there was no significant difference in total number of the papillae between the two groups(P＞0.05).Taste pores were found on 91.1%fungiform papillae(poreless papillae was 8.9%),and there was no fungiform papillae with a filiform-like appearance in control rats.Compared with control rats,taste pores were found on 59.1%fungiform papillae in diabetic rats,and the number of poreless papillae was significantly increased(P＜0.01),there was fungiform papillae with filiform-like papillae.ConclusionGustatory receptor of type 1 diabetic rat showed a series of atrophy changes. The area of taste buds on fungiform papillae was associated with taste sensitivity.

Diabetes;Fungiform papillae;Taste buds;Rats;

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.001

R-332

A

1003—6350（2017）08—1205—04

2016-11-16)

湖北省卫生厅科研基金（编号：JXIB068）;湖北省十堰市科技局引导型资助项目（编号：14y5Y51)

孟杨。E-mail:Mengyang56@126.com