高效液相色谱法测定木姜叶柯水提取物中根皮苷的含量

陈 文，杜明月，刘浩然

(1.惠州卫生职业技术学院，惠州 516025; 2.湖南大学化学化工学院，长沙 410082)

高效液相色谱法测定木姜叶柯水提取物中根皮苷的含量

陈 文1，杜明月2，刘浩然2

(1.惠州卫生职业技术学院，惠州 516025; 2.湖南大学化学化工学院，长沙 410082)

目的：建立木姜叶柯水提取物中根皮苷的高效液相检测方法。方法：取木姜叶柯水提取物以甲醇溶解后，用高效液相色谱法测定。色谱条件：Kromosi-C18色谱柱；紫外检测波长286 nm；流动相：甲醇-水 (47：53)；流速：1 mL/min；定量环进样20 μL；柱温32 ℃。结果：根皮苷浓度在6.4～102.4 ug/mL范围内线性良好，r=0.9998，其平均回收率分别为98.83±0.94%。结论：该法专属性好，回收率高，适合于木姜叶柯中根皮苷的质量控制。

木姜叶柯；根皮苷；高效液相

木姜叶柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun. 为壳斗科植物，分布于越南、缅甸、老挝以及中国大陆秦岭以南各省区［1］。现代研究表明，木姜叶柯含有较多的黄酮类成分［2］。其中较为特殊的二氢查耳酮类根皮苷是一种具有降血糖作用的活性成份［3］，以根皮苷为先导化合物合成的坎格列净目前已作为葡萄糖转运体抑制剂应用于临床［4］。

根皮苷很早就被人从植物中发现，目前多从苹果皮及树枝中提取［5］。此外，湖北海棠中亦发现了含量较为丰富的根皮苷［6］。木姜叶柯及其变种多穗柯则是另一类根皮苷较为丰富的植物［7］。提取木姜叶柯中的总黄酮已有相关报道［8］。本实验在前期研究的基础上，以热水提取法获得根皮苷，并以高效液相色谱法建立了其含量测定方法。

1 资料与方法

1.1 药品与试剂 木姜叶柯，采集于罗浮山区，其原植物经广州中医药大学彭光天博士及华南农业大学李镇魁副教授鉴定为壳斗科柯属植物木姜叶柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun. ，植物标本存放于惠州卫生职业技术学院；根皮苷（对照品，西安天瑞植物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Tedia试剂公司）；乙腈（色谱纯，美国Tedia试剂公司）；超纯水为自制品。其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器 高效液相色谱系统：LC-20AT 二元溶剂输送泵，SPD-20A紫外检测器，日本岛津制作所；KQ-3200E型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；AL204型精密电子天平，瑞士梅特勒－托利多公司。

2 结果

2.1 供试品溶液的制备 将木姜叶柯干燥叶片剪成碎片，称取5.0 g，置500 mL圆底烧瓶中，按料液比1：20加入去离子水，回流提取1小时，趁热抽滤。滤液浓缩，减压干燥，得浅棕色粉末，称重。精密称取提取物20mg，加入100mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容。以移液管移取6ml，置50ml容量瓶中，以甲醇定容，以0.22 μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液，备用。

2.2 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），瑞典Akzo Nobel公司。检测波长：286 nm；流动相：甲醇：水＝47：53。流速：1.0 mL/min。柱温：32 ℃。进样量：20 μL。

2.3 专属性实验 取供试品溶液，经反复摸索，获得主要色谱峰能分开且保留时间相对较短的色谱条件。以根皮苷对照品进样，可知其保留时间约5.5min，与其它成份之间无干扰（图1）。

图 1 根皮苷对照品 (a) 、及木姜叶柯水提取物 (b) 的高效液相色谱图

2.4 线性关系考察 精密称取根皮苷12.8mg，以甲醇配制成根皮苷浓度为102.4 μg/mL、51.2 μg/mL、25.6 μg/mL、12.8 μg/mL、6.4μg/mL的系列对照品溶液。取上述对照品液，按2.2项下的色谱条件进样，每次进样20 μL，记录色谱图。以对照品浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。根皮苷浓度与峰面积的线性关系为：A=50376C-5688.9，r=0.9998。

2.5 精密度试验 取浓度为25.6 μg/mL的对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，每次进样20 μL。以根皮苷面积计算相对标准偏差（RSD）。其RSD为0.79% （表1）。

表1 HPLC测定根皮苷的精密度 (n=6)

2.6 重复性试验 取某一批次的样品精密称定，共计6份，依上述方法测定。测得热水提取物的平均含量为93.12±1.76%，表明含量测定重复性良好（表2）。

2.7 稳定性试验 分别取精密度项下的供试品溶液在0、4、8、12、18、24 h的时间进样，记录色谱图，考察供试品溶液的稳定性。虽然在12h后测得其含量略有下降，但在24 h内其相对标准偏差为1.28%，表明供试品溶液在24h内基本稳定（表3） 。

表2 HPLC测定根皮苷的重复性 (n=6)

表3 HPLC测定根皮苷的方法稳定性

2.8 加样回收率试验 准确称取0.1g热水提取物，分别按照样品含量的80%、100%和120%加入根皮苷对照品甲醇溶液，分别进高效液相测量峰面积，计算加样回收率。测得根皮苷的平均回收率为：98.83±0.94%（表4）。

表4 HPLC测定根皮苷的加样回收率试验结果

2.9 样品测定 我们取热水提取法获得的三个不同批次的样品按2.1项下“供试品溶液的制备”所述方法进行测定。样品测定结果见表5。结果表明以此法获得的提取物，其根皮苷含量均在92%以上。因此，在提取木姜叶柯中的根皮苷时，热水法为一种简便、经济的方法。

表5 根皮苷热水提取物样品的含量测定结果 (n=5)

3 讨论

木姜叶柯与同属植物多穗柯均为壳斗科植物，后者为前者的变种［9］。根据第四次全国中药资源普查广东调查队调查结果显示，木姜叶柯在广东境内的平远县泗水镇等地偶见散生，在博罗县罗浮山独有成片分布（当地居民称之为“罗浮甜茶”），其含有的二氢查耳酮苷类，是除蔗糖等还原糖之外的非糖类天然甜味成份。本实验为系统开发甜茶的基础研究，旨在建立木姜叶柯中根皮苷的含量测定方法，为后期深入开发提供必要的基础。

木姜叶柯水提取物用微孔滤膜直接过滤即可在高效液相色谱仪上进行测定。此法可用于对样品提取进行中间监测。但考虑到根皮苷在热水与冷水中的溶解度相差较大，我们前期实验中考虑获得提取物固体后用甲醇溶解后进样，效果不错。因此我们最终选择用甲醇作溶剂。

根皮苷的吸收峰主要在286nm左右，与其苷元根皮素的吸收峰基本相同［10］。因热水提取物中主要的杂质为根皮素，因此选择286nm为波长亦可相对粗略地了解提取物中根皮苷和根皮素的比例。根皮苷是一种二氢查耳酮的苷类，极性相对较大。曾参照相关文献进行色谱条件摸索［11，12］，发现其中极性较大的微小杂质成份干扰色谱图。通过摸索，最终确定以甲醇：水（47：53）为色谱条件。在此条件下，根皮苷能与其它成份分开，且相对来说保留时间较短，可节约分析时间。有文献报道以醋酸或其它酸性物质加入流动相中改善峰形。我们研究发现，不加醋酸峰形影响不大。为减少加入醋酸后色谱柱冲洗所耗时间，我们选择甲醇／水系统作为流动相。在摸索阶段我们曾尝试采用不同的柱温进行测定，发现柱温在30℃～35℃之间保留时间较为理想。增加柱根皮苷保留时间略有提前，减少柱温保留时间略有推后。最终我们确定以柱温为32℃进行测定。

［1］ 蒋珍藕, 黄明桂, 陆国寿, 等. 木姜叶柯总黄酮分离纯化研究［J］. .中国中医药信息杂志.2011, 18(9): 56-59.

［2］ 周伟, 夏念和. 我国壳斗科植物资源－尚待开发的宝库［J］. 林业资源管理.2011, 2: 93-96.

［3］ 韦宝伟, 刘布鸣, 曾宪彪, 等. 木姜叶柯总黄酮对大小鼠血糖和糖耐量的影响［J］. 现代药物与临床.2012, 27(1): 19-22.

［4］ 郭宗儒. 由根皮苷到坎格列净的上市［J］. 药学学报.2015, 50(5): 633-634.

［5］ 谭飔, 周志钦. 根皮苷研究进展［J］. 食品与发酵工业.2013, 39(8): 182-185.

［6］ 李艳, 黎开燕. 湖北海棠的化学成分和药理活性研究进展［J］. 中国实验方剂学杂志.2016, 22(2): 226-229.

［7］ 李胜华, 伍贤进, 杨青丹, 等. 多穗柯化学成分研究［J］. 中药材.2010, 33(4): 549-551.

［8］ 蒋珍藕, 韦宝伟, 黄明桂, 等. 木姜叶柯总黄酮的提取工艺［J］. 中国实验方剂学杂志.2011, 17(3): 14-16.

［9］ 何春年, 彭勇, 肖伟, 等. 多穗柯甜茶的研究进展［J］. 时珍国医国药.2012, 23(5): 1253-1255.

［10］ 夏冬梅, 李敏, 王道清, 等. 藏药俄色叶中根皮苷、根皮素含量分析［J］. 中国现代中药.2014, 16(8): 618-622.

［11 冉军舰, 樊明涛, 赵政阳, 等. 高效液相色谱法测定不同品种苹果芽中根皮苷的含量［J］. . 食品科学.2013, 34(20): 157- 160.

［12］ 邱宏聪, 李茂, 蒋珍藕. RP-HPLC法测定多穗柯药材中根皮苷的含量［J］. 药物分析杂志.2010, 30(5): 900-902.

Assay of phlorizin from the water extract of Lithocarpus litseifolius by high performance liquid chromatography

Wen Chen1, Mingyue Du2, Haoran Liu2
(1. Huizhou Health Sciences Polytechnic, Huizhou 516025, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hu’nan University, Changsha 410082, China)

Objective To establish a method for the determination of phlorhizin from the extract of Lithocarpus litseifolius by high pressure liquid chromatography (HPLC). Methods Lithocarpus litseifolius was extracted by hot water, and the phlorhizin was determined by HPLC. Chromatographic condition: Kromosi-C18 column, ultraviolet detector, wavelength 286 nm, mobile phase: methanol water (47:53), flow rate: 1.0 mL/min, sample volume: 20 μL; Column temperature: 32℃. Results The phlorhizin concentration ranged between 6.4～102.4 μg/mL showed good linear（r=0.9998）, and the average recovery was 98.83 ±0.94%. Conclusion The method is suitable for the quality control of phlorhizin in Lithocarpus litseifolius with good specificity and recovery.

lithocarpus litseifolius; phlorhizin ; high performance liquid chromatography

R284

A

1673-016X（2017）02-0190-03

2017-01-13

惠州市科技计划项目 (2014B04000 004)

刘浩然，E-mail:295423884@qq.com