西瑞香素半乳糖化脂质体在大鼠体内组织分布的研究

颜红+欧阳婷+杨琼梁+向彪+夏新华

[摘要] 研究西瑞香素半乳糖化脂质体在大鼠体内的组织分布。按剂量10mg·kg^-1给予健康sD大鼠单剂量尾静脉注射西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂质体、西瑞香素半乳糖化脂质体，分别于给药5，15，30，45，60，120，240，360 min后采集大鼠全血和心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、胸腺组织，采用HPLC测定血浆和各组织中西瑞香素的浓度。对比3组制剂，结果发现在不同时刻单位质量肝脏中西瑞香素的含量均以西瑞香素半乳糖化脂质体组为高；所有时间点西瑞香素半乳糖化脂质体对肝脏的靶向指数DTI值均大于西瑞香素普通脂质体，西瑞香素半乳糖化脂质体在肝组织的AUC和C分别为西瑞香素溶液的2.23，5.22倍。表明西瑞香素半乳糖化脂质体能够在肝脏部位浓集，具有显著的肝脏靶向性。

[关键词]西瑞香素；半乳糖化脂质体；肝靶向；组织分布

西瑞香素，化学名为7-羟基-6-甲氧基-3，7-.双香豆素酯，为香豆素类化合物，广泛存在于豆科、瑞香科及芸香科等种属植物中。文献报道西瑞香素对人肺腺癌细胞AGZY-83-a，人喉癌细胞Hep2，人肝癌细胞HepG2均有明显抑制作用，且呈浓度依赖性。此外，西瑞香素还有抗炎镇痛和抗病毒等生物活性，但该药物在水中溶解度差，在一定程度上限制了其应用。脂质体是一种可将药物包封于类脂质双分子层形成的薄膜中间所得的超微型球体载体，具有保护药物、降低药物毒性、提高制剂稳定性等优点。本试验在将西瑞香素制备成脂质体的基础上，研究西瑞香素半乳糖化脂质体在大鼠体内心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑和胸腺等组织的分布特性，为其进一步研究开发与临床应用提供参考依据。

1材料

Agilent 1200型高效液相系统（美国安捷伦公司，包括G1311A型泵、G1314B型紫外检测器、G1329A自动进样器）；Thenn0 hypersil BDS色谱柱（4.6mmx250mm，5 Ixm）（美国Therm0）；WH-2微型旋涡混合仪（上海楚定分析仪器有限公司）；ZEN3600纳米粒度及电位分析仪（英国Malvern公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华有限公司）；Sonic Dismembrator Model 500超声波细胞粉碎机（美国Fisher Scientific公司）；FM70A制冰机（意大利Grant公司）；ZEN3600纳米粒度及电位分析仪（英国Malvem公司）；YY/T0657-2008立式高速冷冻离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；TD6台式低速自动平衡离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；可调式移液器20—200，200～1 000 IxL（大龙医疗设备有限公司）；BTl25D分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；氮气吹干仪（自制）；一次性使用无菌注射器（圣光医用制品有限公司）；玻璃匀浆器（海门市华凯实验玻璃仪器有限公司）；SK2200HP超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）。

西瑞香素（中国食品药品检定研究院，含量99.4%，批号111758-201101）；补骨脂素对照品（中国食品药品检定研究院，批号110739-201115）；0.9%氯化钠注射液[回音必集团（江西）东亚制药有限公司]；大豆磷脂Lipoid S100（德國Lipoid公司）；胆固醇（SIGMA公司）；磷酸盐缓冲剂（粉剂，0.01 mol·L^-1，pH 7.4，北京鼎国生物技术有限责任公司）；二甲亚砜（DMSO，北京鼎国生物技术有限责任公司）；1，2.丙二醇、乙醇为生化级，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

健康SD大鼠，雄性，体重（300±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号4300470000565 1。

2方法与结果

2.1色谱条件

Therm0 hypersil BDS C₁₈色谱柱（4.6mmx250mm，5μm）；流动相甲醇-0.2%磷酸（41：59）；流速1.0 mL·min_-1；检测波长346 nm；柱温30℃；进样量20μL。

2.2溶液的配制

西瑞香素对照溶液：精密称定西瑞香素对照品2.5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为100 mg·L_-1的西瑞香素储备液。精密量取上述西瑞香素储备液适量，分别置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成西瑞香素质量浓度分别为0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10，20 mg·L_-1的系列对照溶液。

补骨脂素内标溶液：取补骨脂素2.5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为100 mg·L_-1的内标储备液。精密量取内标储备液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成4.0 mg·L_-1的内标溶液。

2.3样品的制备

西瑞香素溶液（DAP）的配制：精密称定西瑞香素8.0 mg，依次加入12μL DMSO，2 mL丙二醇，2mL生理盐水，超声溶解，即得2.0 g·L_-1的西瑞香素溶液。

西瑞香素普通脂质体（DAP-LP）的制备：采用乙醇注入法，精密称取磷脂、胆固醇、西瑞香素（10：2.5：1），溶于无水乙醇中（水浴加热），所得的类脂溶液用细孔径注射器缓慢匀速地注入到恒温55℃，pH 7.4的10 mL磷酸盐缓冲液中，注入过程中用磁力搅拌器搅拌，先通氮气除去乙醇，再继续搅拌30min，45℃孵育20min，冰浴超声4min（工作30 s，间隔30 s），过0.45，0.22μm微孔滤膜，即得。

西瑞香素半乳糖化脂质体（Gal-DAP-LP）的制备：除在无水乙醇中加入10%的半乳糖配体外，其他步骤同上。

2.4组织生物样品的处理

取大鼠各组织脏器，除小肠和胃剪开去除内容物后用生理盐水清洗外，其余器官用生理盐水洗净表面浮血，滤纸吸干，置一20℃冷冻保存。测定前取出组织样本，解冻后称质量，剪碎，置于玻璃匀浆器中，加2倍量生理盐水在冰浴中研成匀浆，制成组织匀浆液。分别取各组织匀浆500μL，置于10 mL离心管中，精密加入内标补骨脂素溶液（4.0 mg·L_-1）50μL，涡旋30秒，加入乙腈1mL，涡旋5min，再加入醋酸乙酯5 mL，涡旋混合5 min，以12000r·min_-1。离心5min，取上清液，N，吹干（40℃水浴），残渣加色谱甲醇100μL，涡旋5 min，以12 000r·min_-1离心5min，吸取上清液置内衬管中，即得。

2.5方法学验证

2.5.1专属性考察取大鼠各空白组织匀浆，除不加内标溶液外，其余按2.4项下方法处理，获得空白组织色谱图；将一定浓度的西瑞香素对照品溶液和内标溶液加入大鼠空白组织匀浆中，同法操作，获得空白组织加西瑞香素与内标色谱图；取大鼠给药后的各组织匀浆，同法操作，获得给药后大鼠各组织色谱图，各组织脏腑中色谱图见图1。从色谱图可以看出，西瑞香素与内标物（补骨脂素）的色谱峰与相邻色谱峰分离良好，西瑞香素和内标物的保留时间分别约为22.1，14.8 min。组织中内源性物质及代谢物对测定不产生干扰。

2.5.2线性关系的考察取大鼠空白组织匀浆各500加入西瑞香素系列对照溶液50，配制成相当于西瑞香素组织质量浓度为0.020，0.050，0.10，0.20，0.50，1.0，2.0 mg·L_-1的样品溶液，精密加入内标补骨脂素溶液（4.0 mg·L_-1）50，按2.4项下方法处理，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图和峰面积，以西瑞香素在样品中的质量浓度C（mg·L_-1）为横坐标，西瑞香素与内标物峰面积比值K为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程见表1。结果表明，西瑞香素在0.020～2.0mg·L_-1内线性关系良好。

2.5.3精密度和提取回收率试验用空白组织配制含西瑞香素低、中、高（0.05，0.5，2.0 mg·L_-1）3

由表2，图3，4可见，西瑞香素溶液组在不同时刻单位质量肺中西瑞香素的含量明显高于其他脏器（P<0.01）；而3组制剂在不同时刻单位质量肝脏中西瑞香素的含量均以西瑞香素半乳糖化脂质体组为高；且西瑞香素普通脂质体组、西瑞香素半乳糖化脂质体组单位质量肝脏中西瑞香素的含量明显高于其他脏器，与其他组织比较差异有显著性（P<0.01）。西瑞香素半乳糖化脂质体尾静脉注射5min后，药物在肝脏中的含量最大，随着时间延长，个浓度的组织样品，按2.4项下方法处理，按2.1项下色谱条件测定，考察低、中、高浓度的日内、日间精密度和提取回收率。结果显示，高、中、低3种浓度不同组织匀浆样品的日内RSD≤3.8%，日间RSD≤4.3%（n=5），提取回收率均在85.0%～100%，RSD≤5.7%（n=5），均符合生物样品测定要求。

2.6大鼠体内的组织分布考察

2.6.1大鼠尾静脉注射3种制剂的体内分布试验及结果取120只SD雄性大鼠，体重（300±20）g，随机分成24组，每组5只，给药前禁食12 h，自由饮水。分别按剂量10 mg·kg_-1尾静脉注射DAP，DAP-LP，Gal-DAP-LP。分别于给药后5，15，30，45，60，120，240，360 min时间点处死大鼠，立即解剖采集心、肝、脾、肺、肾等组织。按2.4项下方法处理，制备组织匀浆。按2.1项下测定分析，计算每克组织中的药物量（由于大鼠各组织的质量不均等，比较药物在大鼠体内组织分布时需分析各脏器每克组织的药物含量）。3种制剂大鼠肝脏的药物含量经时分布图见图2，大鼠静脉注射西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂質体、西瑞香素半乳糖化脂质体在不同脏器中的经时分布情况分别见表2，图3，4。肝脏中的量逐步降低，6 h后西瑞香素半乳糖化脂质体组肝脏中药物量为0.51μg·g_-1，而西瑞香素普通脂质体组、西瑞香素溶液组分别为0.45，0.18μg·g_-1。以上结果表明将药物制成脂质体后改变了药物在体内的组织分布，增加了药物在肝脏的含量，且经半乳糖配体修饰的脂质体其肝靶向效果更强。

2.6.2肝靶向性初步评价分别采用靶向指数DTI，相对摄取率和峰浓度比，将靶向制剂

靶向指数表示给予靶向制剂后时刻组织或器官的药物量表示给予非靶向制剂后时刻组织或器官的药物量），靶向指数DTI可用于比较不同制剂对某器官趋向性的差异。

相对摄取率表示给予靶向制剂后求得的I组织或器官药时曲线下面积；AUC表示给予非靶向制剂后求得的I组织或器官药时曲线下面积），AUC根据梯形法计算。

峰浓度比表示给予靶向制剂后I组织或器官的峰浓度C2表示给予非靶向制剂后I组织或器官的峰浓度）。

以上结果表明，相比于西瑞香素溶液，西瑞香素普通脂质体（除60min时间点）、西瑞香素半乳糖化脂质体的肝DTI值均大于1，表明脂质体比药物溶液易于浓集于靶器官——肝脏。所有时间点西瑞香素半乳糖化脂质体对肝脏的DTI值均大于西瑞香素普通脂质体，如5min时西瑞香素普通脂质体、西瑞香素半乳糖化脂质体的肝DTI值分别为3.3，5.2，表明西瑞香素半乳糖化脂质体对肝的靶向性更强。

西瑞香素普通脂质体在肝组织的AUC和C分别为西瑞香素溶液的1.49，3.34倍，而半乳糖化脂质体在肝组织的AUC和C分别为西瑞香素溶液的2.23，5.22倍，说明其对肝的选择性更强，表明西瑞香素半乳糖化脂质体比西瑞香素普通脂质体具有更好的肝靶向性。

3讨论

本试验建立了大鼠组织中西瑞香素药物浓度测定的HPLC方法，考察了西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂质体、西瑞香素半乳糖化脂质体在大鼠体内的组织分布及对肝脏的靶向性。建立的HPLC可靠、稳定，各脏器回收率均在85.0%～100%，符合生物样品测定要求。

西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂质体、西瑞香素半乳糖化脂质体3种制剂经大鼠尾静脉注射后，测定药物在大鼠体内的组织分布。结果显示3组制剂在不同时刻单位质量肝脏中西瑞香素的含量均以西瑞香素半乳糖化脂质体组为高；且西瑞香素半乳糖化脂质体组单位质量肝脏中西瑞香素的含量明显高于其他脏器，与其他组织比较差异有显著性（P<0.01）。采用靶向指数DTI，相对摄取率峰浓度比为评价参数，相比于西瑞香素溶液，西瑞香素半乳糖化脂质体对肝的DTI值均大于1，西瑞香素普通脂质体除60 min时间点外，其他均大于1，且所有时间点西瑞香素半乳糖化脂质体对肝脏的DTI值均大于西瑞香素普通脂质体。西瑞香素普通脂质体在肝组织的AUC和分别为西瑞香素溶液的1.49，3.34倍，而半乳糖化脂质体在肝组织的AUC和C分别为西瑞香素溶液的2.23，5.22倍，表明药物经脂质包封后对肝脏具有一定的靶向效应，而半乳糖配体的引入可进一步提高脂质体对肝脏的靶向性。