石柱黄连根腐病根际土壤细菌微生态研究

宋旭红　王钰　李隆云　谭均

[摘要] 该研究应用Illumina Hiseq 2500高通量測序平台，分析了未种植黄连土壤、黄连健株及病株根际土壤的细菌种群丰富度及多样性变化，并结合土壤养分及酶活变化检测，对黄连根腐病产生的机制进行了深入探讨。高通量测序显示，栽培黄连造成了土壤细菌种群的丰富度的显著降低（P<0.05）和细菌种群多样性的降低；罹患根腐病的黄连植株根际土壤细菌的种群丰富度要显著低于未种植和健康黄连土（P<0.05），种群多样性要显著低于未种植黄连土样（P<0.05），但与健株土样之间差异不显著。对土壤的养分及酶活测定结果表明，栽培黄连造成了土壤pH、有效磷、脲酶活性的显著降低，蔗糖酶活性的显著升高（P<0.05）；根腐病土样中有机碳的含量、碱解氮、过氧化氢酶和脲酶活性显著低于健康土样，速效磷和速效钾含量显著高于健康土样（P<0.05）。综合分析表明，栽培黄连造成了土壤中细菌种群丰富度和多样性的降低；病株土样中，细菌种群丰富度的显著降低和种群多样性的降低，有可能是导致黄连根腐病产生的一个重要原因，此外，土壤有机碳和过氧化氢酶活性的显著减低，也许是导致黄连根腐病发生的一个诱因。

[关键词] 黄连； 根腐病； 土壤酶活性； 土壤养分； 高通量测序； 细菌

Research on bacteria microecology in root rot rhizosphere soil of Coptis chinensis produced in Shizhu city

SONG Xuhong1，2，3， WANG Yu1，2，3， LI Longyun1，2，3*， TAN Jun1，2，3

（1. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing 400065， China；

2. Chongqing Engineering Research Center for Fine Variety Breeding Techniques of Chinese Materia Medica，

Chongqing 400065， China；

3. Chongqing Subcenter of National Resource， Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese

Medical Science， Chongqing 400065， China）

[Abstract] Illumina Hiseq 2500 highthroughput sequencing platform was used to study the bacteria richness and diversity， the soil enzyme activities， nutrients in unplanted soil， rootrot and healthy rhizophere soil of Coptis chinensis for deeply discussing the mechanism of the rootrot of C. chinensis. The highthroughput sequencing result showed that the artificial cultivation effected the bacteria community richness and diversity. The bacteria community richness in healthy and diseased rhizosphere soil showed significant lower than that of in unplanted soil （P<0.05） and declined bacteria diversity. The bacteria community richness in rootrot rhizosphere soil increased significantly than that of health and unplanted soil and the diversity was lower significant than that of unplanted soil （P<0.05）. The results of soil nutrients and enzyme activities detected that the pH value， available phosphorus and urease activity decreased and the sucrase activity increased significantly （P<0.05）. The content of organic carbon and alkaline hydrolysis nitrogen the catalase and urease activity in root rot soil samples was significantly lower than that of healthy soil samples （P<0.05）. However， the contents of available phosphorus and available potassium were significantly in rootrot sample higher than that of healthy soil samples （P<0.05）. Comprehensive analysis showed that the artificial cultivation declined the bacteria community richness and diversity. The bacteria community richness decreased significantly and the decreased diversity may be the cause of the rootrot. Meanwhile， the decrease of carbon and the catalase activity may be another cause of the rootrot in C. chinensis produced in Shizhu city， Chongqing province.

[Key words] Coptis chinensis； rootrot； enzyme activities in soil； the nutrients of soil； illumina highthroughput sequencing； bacteria

黄连Coptis chinensis Franchet为毛茛科多年生草本植物，以根茎入药，药材名味连、鸡瓜连，为2015年版《中国药典》[1]一部收录，是我国常用大宗中药材。黄连主要分布于重庆市东部、湖北省西部、湖南省北部、陕西省南部、贵州省等地，现主产于重庆市石柱县及湖北省利川市。石柱黄连的市场销售量为我国黄连销售量的60%以上。石柱黄水镇周边栽培黄连已有400多年的历史。近年来，随着黄连栽培面积的不断扩大，土地重复栽连等导致石柱黄连病害尤其是黄连根腐病发生日益严重。

中药材根腐病主要由真菌、细菌和线虫等引起[2]，土壤微生物区系及生理代谢的变化也会引起中药材土传病害的发生[34]。对石柱黄连根腐病的调查发现，黄连根腐病常年发病率10%～20%，严重的地块发病率在60%～90%，甚至绝收，黄连根腐病的发生直接影响黄连药材的产量和质量，给连农造成较大的经济损失。根腐病发生后，连农一般采取拔除病株等方法，很难根除根腐病病菌[5]。到目前为止，还没有一种有效的防治黄连根腐病的方法。因此全面分析和比较未种植黄连土壤、健康黄连土壤和罹患病害黄连根际土壤的养分，酶活及土壤微生物种群多样性变化对揭示黄连根腐病的发生规律和机制尤为必要。

本研究对未种植黄连的土壤、黄连健康植株和发生根腐病的植株的根际土壤进行了养分、酶活等分析，同时采用Illumina Hiseq2500 PE250高通量测序平台，对以上3种土壤的细菌进行种群组成、丰富度及多样性变异分析，以期深入了解黄连根腐病发生的机制，为综合防治提供科学依据，以促进石柱黄连产业健康、可持续性发展。

1 材料和方法

1.1 实验设计 取样地点在重庆市石柱县黄水镇GAP种植基地（东经108°26′，北纬29°59′），海拔1 667 m，年降水量为1 200 mm，年平均气温为16 ℃。以三年生栽培黄连健康和发病植株根际、未种植黄连土壤为研究对象。在根腐病发生盛期内（2015年8月5日），利用抖根法获得黄连根际土壤样本，2种处理土样均采用5点取样，每个取样点至少取10株，混合土壤，一部分用灭菌的镊子挑拣出植物残渣后转入灭菌袋中，放入车载冰箱及时带回，然后-80 ℃超低温冰箱保存供提取DNA使用；一部分挑出植物残渣后常温下阴干，过筛后做土壤养分及酶活性测定使用。同时采集种植黄连地块周围未种植过黄连的土壤，小心清理干净土层表面覆土，在深度为5～15 cm土层，五点取样，混合样本处理同根际土。黄连健株、病株根际土在文章中分别表示为H.RMS3 和D.RMS3；未种植黄连的土壤记为N.RMS3。

1.2 土壤养分及土壤酶活性检测 土壤pH采用土水比例为1∶20；有机碳含量测定采用重铬酸钾容量法稀释热法测定，土壤碱解氮采用碱解扩散法，速效钾采用NH4OAc浸提火焰光度法，速效磷分别采用钼锑抗比色法测定法[6]。土壤脲酶、蔗糖酶、纤维素酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和酸性蛋白酶活性检测使用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒。

1.3 土壤总DNA提取 使用美国MP 生物公司（Fast DNATM SPIN Kit for Soil）土壤DNA提取试剂盒提取土壤总DNA，利用琼脂糖电泳检测DNA的纯度和浓度，用灭菌后的超纯水稀释至1 mg·L-1。

1.4 土壤细菌扩增及测序等后续分析 16SV4区引物为F515（5′GTGCCAGCMGCCGCG3′）和R806 （5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′）。根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带（400～450 bp）使用德国Qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。

使用TruSeq DNA PCRFree Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和QPCR定量，文库合格后，使用北京诺禾致源生物信息科技有限公司的Hiseq2500 PE250平台进行上机测序及分析。测序结束后，对各样品数据进行去杂、拼接[7]、过滤[8]、去除嵌合体[9]等处理，得到最终有效数据（effective tags）。根据序列相似性（大于97%）形成操作分类单元（operational taxonomic units，OUTs），RDP Classifier方法（Version 2.2，http：//sourceforge.net/projects/rdpclassifier/[10]与GreenGene数据库（http：//greengenes.lbl.gov/cgibin/nphindex.cgi）進行物种注释分析[11]，使用PyNAST软件（Version 1.2）[12]与GreenGene数据库中的“Core Set”数据信息进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。 最后对各样品的数据进行均一化处理，以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。 使用Qiime（Version 1.7.0）计算Observedspecies，Shannon，Simpson，Chao 1，ACE指数及反映测序深度的Goodcoverage指数并计算Unifrac距离、构建UPGMA样品聚类树。使用R软件（version 2.15.3）绘制稀释曲线，Veen图和物种丰富聚类热图和β多样性指数热图。

1.5 数据统计分析 采用Excel 2003和SPSS 16.0（SPSS Inc.，USA）软件对数据进行统计分析，采用最小显著差数法（Oneway ANOVA，LSD）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 未种植黄连、黄连健株和病株土样养分变化 未种过黄连的土pH显著高于病株和健株黄连根际土壤（P<0.05），健株黄连根际土壤有机碳含量显著高于病株土样和未种植黄连土样（P<0.05），但是病株根际土和未种植黄连根际土有机碳含量差异不显著；3种处理土样碱解氮的变化为健株土样最高，未种植土样次高，病株土样最低，三者之间差异显著（P<0.05）。速效磷的含量变化为未种植土样最高，病株土样其次，健株土样最低，三者之间差异显著（P<0.05）。速效钾的含量在病株土样中最高，显著高于健株和未种植黄连土样（P<0.05），但是健株和未种植黄连土样速效钾含量差异不显著，见表1。

2.2 未种植黄连、黄连健株和病株土样酶活性的变化 3种处理土壤之间酸性磷酸酶和酸性蛋白酶活性之间差异不显著；病株土样多酚氧化酶活性高于与健株土样和未种植黄连土样该酶活性，但与健株土样之间差异不显著，但是，健株土样和未种植黄连土样之间差异不显著。健株土样中过氧化氢酶的活性显著高于病株土样和未种植黄连土样（P<0.05），其中，病株土样该酶活性为3种土样之中最低。脲酶活性以未种植黄连土样最高，健株土样次高，病株土样最低，三者间差异显著（P<0.05）。蔗糖酶的含量以病株土样最高，健株土样次之，未种植黄连土样最低，三者之间差异显著（P<0.05），见表2。

2.3 未种植黄连、黄连健株和病株土样细菌的α多样性分析 对黄连健株、病株及未种植黄连土样运用Hiseq2500/PE250测序平台进行高通量测序，过滤嵌合体后，最终用于后续分析的Effective Tags序列共153 493条，其中健株土样有54 587条，病株土样有45 497条，未种植黄连土样有53 409条，见表3。用于后续分析的Effective tags数目之多，说明采用该方法足以用于3种处理土样的细菌多样性分析。

对3种土样细菌α多样性指数进行分析表明，未种植黄连土样细菌的种群多样性指数（Shannon）显著高于健株和病株土样（P<0.05），健株土样细菌种群多样性指数显著高于病株土样（P<0.05）；从种群丰富度指数（observedspecies，Chao1 和ACE）差异可以看出，未种植黄连土样的细菌丰富度要高于种植黄连的土样，罹患根腐病的黄连根际土壤细菌丰富度低于健株和未种植黄连土样，其中与未种植黄连土样之间差异显著（P<0.05），见表4。

2.4 物种稀释曲线和Veen图 黄连健株、病株根际土和未种植黄连土壤细菌稀释曲线比较平坦，说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种。从Venn图可以看出，健康植株土样（H.RMS）有767个特有的OTUs，未种植黄连土壤特有747个OTUs，而根腐病病株土壤（D.RMS）仅有219个特有的OUTs，见图1。

2.5 未种植黄连土样与黄连健株、病株土样物种相对丰富度分析 未种植黄连和黄连病株、健株土样细菌在门水平上的丰富度差异比较大。未种植黄连土样细菌中，按照种群的相对丰度从高到低进行排列，依次是变形菌门（Proteobacteria，38.83%）、酸杆菌门（Acidobacteria，26.19%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，7.65%）、浮霉菌门（Planctomycetes，5.95%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，5.08%）、厚壁菌门（Firmicutes，4.50%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，2.60%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae，2.01%）、放线菌门（Actinobacteria，1.50%）、绿弯菌门（Chloroflexi，1.50%）、WS3（1.19%）和泉古菌门（Crenarchaeota，0.37%）；在黄连病株土壤细菌中，相对丰度依次为变形菌门（49.72%）、酸杆菌门（17.81%）、厚壁菌门（5.86%）、拟杆菌门（4.64%）、泉古菌门（4.63%）、疣微菌门（4.38%）、放线菌门（4.01%）、浮霉菌门（2.63%）、芽单胞菌门（1.99%）、绿弯菌门（0.72%）、硝化螺旋菌门（0.44%）和WS3（0.11%）；在黄连健株根际土壤细菌中，相对丰度由高到低依次为：变形菌门（51.34%）、酸杆菌门（16.70%）、拟杆菌门（6.18%）、放线菌门（5.73%）、疣微菌门（5.16%）、芽单胞菌门（3.18%）、浮霉菌门（3.05%）、厚壁菌门（2.62%）、泉古菌门（1.39%）、绿弯菌门（1.20%）、硝化螺旋菌门（0.75%）和WS3（0.23%），见图2。

差异显著性分析可知，3个处理土样中，疣微菌门，拟杆菌门，硝化螺旋菌门，绿弯菌门差异不显著；未种植黄连土样中，变形菌门、放线菌门和泉古菌门相对丰度显著低于2种栽培黄连土样（P<0.05），厚壁菌门和芽单胞菌门介于健株和病株之间，三者差异不显著，酸杆菌门、浮霉菌门和WS3在未种植黄连土样中的相对丰度显著高于种植黄连土样（P<0.05）。病株和健株土样之间酸杆菌门、浮霉菌门和WS3差异不显著；健株中厚壁菌门、泉古菌门相对丰度显著高于病株土样，芽单胞菌门相对丰度显著低于病株土样（P<0.05）。

为了更直观的展现未种植黄连土样和健株、病株黄连根际土壤细菌种群的相似性及变异，根据所有样品在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35的属，根据其在每个样本中的丰度信息，从物种和样品2个层面来聚类，生成热图，见图3。在丰富度排名前35的属种，仅有Streptomyces在未种植黄连土壤中为0，其余34个属在3种处理土样中均有。未种植黄連土壤中细菌的相对丰度较其余2种均高的属为：DA101，Planctomyces，Nitrospira，Methylibium，Gemmata，Pirellula，Opitutus，Steroidobacter，A17；在健株土样中，下列属的相对丰富度高于病株土样和未种植黄连土样，分别是：Kaistobacter，Rhodoplanes，Burkholderia，Janthinobacterium，Pseudomonas，Flavobacterium，Chryseobacterium，Sphingopyxis，Sphingomonas，Streptacidiphilus，Pedobacter，Mesorhizobium，Agrobacterium，Cupriavidus。在病株中相对丰度较健株和未种植黄连土样均高的有：Rhodococcus，Nitrosotalea，Candidatus Koribacter，Rhodanobacter，Candidatus，Solibacter，Oscillospira，Allobaculum，Phenylobacterium，Aquicella，Bacteroides，Ruminococcus，Edaphobacter，Fimbriimonas。

2.6 未种植黄连土样与黄连健株、病株土样细菌的β多样性分析 病株和健株土样先聚在一起后和未种植黄连的土样聚在一起，病株土样细菌种群和健株土样之间的相异系数为0.205，病株与未种植黄连土样之间的相异系数为0.352，健株与未种植黄连土样细菌种群之间的相异系数为0.254。上述结果说明，未种植土样细菌种群组成与健株之间的相似度大于与病株之间的相似度，同时说明，黄连根腐病显著改变了黄连根际土细菌种群的组成，见图4。

3 结论与讨论

土壤酶是土壤生态系统中活跃的生物活性物质，在驱动土壤代谢和土壤中养分物质循环及养分的有效释放过程中起重要作用，是土壤品质和生态系统稳定的重要指标[13]。土壤理化性质和酶活性的变化可以引起植物根际土壤微生物的变化[14]。因此，详细了解土壤理化性质和酶活性对了解黄连根腐病的发生机制具有重要的意义。土壤脲酶能促进土壤中含氮有机化合物酰胺肽键的水解，生成的氨是植物氮素营养的来源之一；蔗糖酶又叫转化酶，主要参与土壤中碳水化合物的转化，其活性强弱反应土壤熟化程度和肥力水平，土壤肥力越高其活性

纵向为样品信息，横向为物种注释信息，左侧的聚类树为物种聚类树，上方的聚类树为样品组间的聚类树；中间热图对应的值为每一行物种相对丰度经过标准化处理后得到的Z值，即一个样品在某个分类上的Z值为样品在该分类上的相对丰度和所有样品在该分类的平均相对丰度的差除以所有样品在该分类上的标准差所得到的值。

a.样品的聚类分析，左侧是UPGMA聚类树结构，右侧的是各样品在门水平上的物种相对丰度分布图；b. β多样性指数热图，图中方格中的数字是Weighted Unifrac距离计算出的样品两两之间的相异系数，相异系数越小的2个样品，物种多样性的差异越小。

也越强。这2种酶均与土壤矿质营养密切相关，酶活性的高低影响作物可吸收利用的有效营养物质多寡。病株土样中速效钾和速效磷含量较健株土样显著升高，尤其是速效钾的3倍量增加，说明病株土壤肥力水平要显著高于健株土样，也跟研究中病株土样蔗糖酶活性的显著升高相一致。病株土样中，脲酶活性的降低减少了土壤中含氮有机物酰胺肽键的水解，造成了病株土样中碱解氮的显著降低。过氧化氢酶能够减轻土壤中的过氧化氢对生物体的毒害作用。在本研究中，病株土壤的过氧化氢酶活性显著低于健株土壤和未种植黄连土壤，这就有可能造成黄连植株根部有毒害物质积累过多，对黄连植株产生毒害作用，从而造成根部病害的发生。

有研究表明，有机碳含量高可提高土样中微生物活性，增加细菌的多样性[1516]。有机碳含量低，且土壤碳氮比率变小，使得甜菜发生根腐病发生严重[17]。在本研究中，有機碳的含量在健康土样中显著高于病株和未种植黄连土样。说明黄连根腐病的发生可能与黄连土壤中有机碳含量的降低有一定的关系。

16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上，包括 10 个保守区域（conserved regions）和 9 个高变区域（hypervariable regions），其中高变区具有属或种的特异性，随亲缘关系不同而有一定的差异，16S rRNA的V4区是常用的扩增目标区，已经被证实可以很好的用来分析根际土壤的细菌种群多样性变化[12，1920]及再植性病害土壤分析[21]。

微生物种群的丰富度和变异在土壤质量、功能和土壤生态系统的可持续性发展中扮演着重要的角色[22]。在某种程度上，土壤微生物群落的组成变化、群落类型或者微生物量的变化可以放映出土壤质量的变化[23]。有研究表明，土壤微生物种群丰富度的降低和变异性的降低可能跟连作障碍[24]和植株罹患病害有一定的关系[25]，Yang 等[26]也发现，健康植株根际土壤的细菌多样性显著高于发病植株。在种植了黄连的2种处理土样中，健康植株的根际土细菌种群丰富度和多样性要高于罹患根腐病的土样。因此，在本研究中，根腐病病株根际土样较健株土样和未种植黄连土样的细菌种群丰富度和多样性的降低，可能是诱导黄连罹患根腐病的一个重要原因。

在种植黄连土样中，健株和病株土样中变形菌门、酸酐菌门、放线菌门、疣微菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、消化螺旋菌门、绿弯菌门和WS3差异不显著；根腐病病株土壤中厚壁菌门和泉古菌门的相对丰度显著高于健株土样，而芽单胞菌门的相对丰度则显著低于健株土样（P<0.05）。在黄连健株土样细菌属中，伯克氏菌属Burkholderia等14个属的相对丰度较病株和未种植黄连土样高，其中，假单胞菌属Pseudomonas[2728]、伯克氏菌属[2931]、土壤杆菌属Agrobacterium[30]、黄杆菌属Flavobacterium[32]中的一些种已被证明是具有生防和促生作用的有益菌群。但是，这几个属也是植物常见病原细菌较为集中的属[33]，黄连健株土样中的这几个属对植物生长是促进还是抑制，可能决定于这些细菌在根际土壤中代谢产物的浓度，因此，在没有经过体外试验，盆栽和大田试验的严格筛选之前，不能肯定上述属就是造成黄连根腐病发生的一个重要因素。

有研究表明，黄连须根浸提液对细菌起到一定的抑制作用[34]，黄连根系分泌的酚酸类物质也是影响黄连细菌数量的一个重要原因[35]。在本研究中，未种植黄连的土壤中，细菌的种群多样性显著高于种植过黄连的土样，种群的细菌丰富度也高于种植过黄连的土样。也就是说，黄连的种植，降低了黄连种植土壤细菌种群丰富度和多样性。在对3种处理土样中丰富度排名前12门进行比较分析可知，未种植黄连的土样细菌中变形菌门，放线菌门和泉古菌门相对丰度显著低于2种栽培黄连土样，酸杆菌门，浮霉菌门和WS3在未种植土样中的相对丰度显著高于种植黄连土样。栽培黄连是通过什么途径改变了这6个细菌门在土壤中的相对丰度，是黄连根际分泌或者是植株在自然条件下的降解物，亦或者是人工栽培措施（施肥等）改变了连田的土壤细菌群落，是下一步值得深入研究的课题。

总之，本研究表明，黄连种植造成了土壤中pH值、速效磷、脲酶的显著降低和蔗糖酶的显著升高，未栽培黄连土样中变形菌门、放线菌门、泉古菌门的丰度显著低于2种栽培土样，酸杆菌门、WS3则显著高于2种栽培土样。黄连根腐病土样中，有机碳、过氧化氢酶活性和细菌种群丰度的显著降低及细菌种群多样性的降低有可能是造成黄连根腐病的重要原因，但是，黄连根腐病发生的原因比较复杂，仅仅从土壤养分、酶活变化及土壤根际细菌多样性变化的角度来解释缺乏充分的理论依据，黄连化感物质的种类，化感物质跟土壤微生物之间的关系也值得深入研究。

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[责任编辑 吕冬梅]