阿司匹林与华法林联用在大鼠体内的药效学研究

周峰++赵青

【摘 要】目的：研究阿司匹林与华法林联用在大鼠体内的疗效。方法：取成年SD雄性大鼠60只，体重180-200g之间，随机分为三组：空白组、单用华法林组、阿司匹林与华法林联用组。三组均灌胃7天，空白组灌服生理盐水，单用华法林组灌服华法林（0.2mg/kg），联用组灌服阿司匹林（10mg/kg）+华法林（0.2mg/kg）。七天后腹主动脉采血法测定三个药效学指标：血小板聚集抑制率、凝血酶原时间和国际标准化比值、血小板胞内[Ca2+]i。结果：SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测定，血小板聚集功能：空白组血小板聚集抑制率0.5%，单用华法林组血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+华法林组血小板聚集抑制率68%，三组比较差异有统计学意义，P<0.05；凝血酶原时间和国际标准化比值：空白组凝血酶原时间16.7s，国际标准化比值1.12；单用华法林组凝血酶原时间20.1s，国际标准化比值1.58；阿司匹林+华法林组凝血酶原时间23.8s，国际标准化比值1.92，三组比较差异有统计学意义，P<0.05。血小板胞内[Ca2+]i测定：空白组血小板胞内[Ca2+]i （67.7±12.9）nmol/L；单用华法林组血小板胞内[Ca2+]i（54.5±11.4）nmol/L；阿司匹林+华法林组血小板胞内[Ca2+]i（43.7±10.9）nmol/L，三组比较差异有统计学意义，P<0.05。结论：阿司匹林与华法林联用抗凝作用优于单用华法林组，可以用于凝血功能严重亢进，单用华法林无法有效控制的患者中，可以取得较好的抗凝效果，但是同时应注意两药联用后的出血倾向，在实际应用中视具体情况而选择药物配伍。

【关键词】阿司匹林 华法林 联用

1 资料与方法

1.1 一般资料

取成年SD雄性大鼠60只，体重180-200g之间，随机分为三组：空白组、单用华法林组、阿司匹林与华法林联用组。

1.2 方法

三组均灌胃7天，空白组灌服生理盐水，单用华法林组灌服华法林（0.2mg/kg）），联用组灌服阿司匹林（10mg/kg）+华法林（0.2mg/kg）。七天后腹主动脉采血法测定三个药效学指标：血小板聚集抑制率、凝血酶原时间和国际标准化比值、血小板胞内[Ca2+]i。

1.2.1 血小板聚集功能

（1）富血小板血浆（PRP）和贫血小板血浆（PPP）的制备。将灌胃后大鼠抽血于3.8%枸橼酸钠抗凝管内，800rpm离心6min得上清液即为富血小板血浆（platelet-rich plasma， PRP），剩余血液继续离心2000rpm×10min得贫血小板血浆（platelet-poor plasma， PPP），用PPP调PRP血小板数为3×108/ml。

（2）Born比浊法测定血小板聚集功能于比浊管内加入500μl PPP调零（100%），同样取500μlPRP，放入另一比浊管中，37℃预热2min，加入诱导剂ADP，在电磁搅拌下观察并记录5min内血小板聚集情况，记录血小板最大聚集率。按公式计算聚集抑制率：血小板聚集抑制率（%）=（对照组血小板聚集率—给药组血小板聚集率）/正常对照血小板聚集率×100%。

1.2.2 凝血酶原时间的测定和国际标准化比值的计算

将冷冻保存的血浆解冻，取0.1 mL，37℃水浴预热3分钟，迅速加入预热的PT试剂0.2 mL，混匀后立即计时，记录凝血丝出现的时间，每个血样重复测定两次，两次测定差值应在2S之内，取平均值，即为PT值。另取未用药大鼠6只，测得其血浆PT值的均值为s，作为正常值（PTnor），与用药大鼠的PT实验值（PTexp）一同用于INR的计算：INR=（PTexp/PTnor）ISI，其中 ISI（International Sensitive Index）为国际敏感度指数，其值为1.85。

1.2.3 血小板胞内[Ca2+]i测定

（1）洗涤血小板悬液的制备。取1.1项方法制备的PRP，加1/4体积的ACD缓冲液（44mM枸橼酸钠，20mM柠檬酸，74mM葡萄糖，pH5.0），离心得片状沉淀，用洗涤液（113mM NaCl，4mM KCl，24mM NaH2PO4，4mM Na2HPO4，0.2mM EGTA，0.1%葡萄糖，pH6.1）洗涤，离心1500rpm×10min，Hepes-Tyrode液（134 mM NaCl，12 mM NaHCO3，0.34 mM NaH2PO4，2.9 mM KCl，1 mM CaCl2，0.8 mM MgCl2，5 mM HEPES，5 mM 葡萄糖 pH 7.4）悬浮，调整血小板密度为2×108/ml。

（2）负载血小板悬液（Fura-2 platelet supension，FPS）的制备。将血小板悬液加入Fura-2/AM（荧光染料），使其终浓度为5μM，37℃恒温避光温育45min，使Fura-2/AM载入细胞内，将已负载的血小板悬液离心2000rpm×10min，去掉上清液，用洗涤液洗涤2遍后用Hepes-Tyrode液重新悬浮。调整血小板数至2×108/ml，测定荧光强度。

（3）血小板胞内[Ca2+]i测定。应用岛津RF-5301PC荧光分光光度计作波长扫描，发射波长（Em）于500nm，扫描负载血小板悬液的激发波长，如激发波长（Ex）波峰由380nm移至340nm，表明Fura-2/AM已负载酯解进入细胞内，可作[Ca2+]i荧光测定。测定时Em为500nm（波宽10nm），Ex分别为340nm和380n（波宽5nm），波長变换时间间隔为2s。按以上参数执行双波长测定，测定分组：分为静息态和激活态（加入PAF，终浓度0.75ug/ml），静息态和激活态均包括0.9%氯化钠注射液组（NS组）和给药组。应用荧光比值法连续描记静息态和激活态的荧光强度比值（F340/F380）变化以及最大荧光强度比值（Rmax），最小荧光强度比值（Rmin）。

钙离子浓度计算基本公式：

[Ca2+]i=Kd·[（R-Rmax）/（Rmin-R）]·（S1/S2）。〔公式中Kd是Fura-2与Ca2+反应的解离常数，37℃时为224nmol/L；Rmax是胞外游离钙为1mmol/L时，加入Triton X-100（10%）破膜剂使Fura-2被Ca2+全部饱和时所测得的荧光比值；Rmin是Fura-2所结合Ca2+被EGTA全部螯合时的荧光比值。S1和S2分别为零Ca2+和Ca2+飽和时，在Ex 380nm测得的荧光强度。〕

1.3 统计学方法

使用统计学软件spss18.0对所得数据进行统计学分析，计数资料采用x2检验，计量资料采用t检验，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 血小板聚集功能

SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测血小板聚集功能，其中空白组血小板聚集抑制率0.5%，单用华法林组血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+华法林组血小板聚集抑制率58%，三组比较差异有统计学意义，P<0.05。

2.2 凝血酶原时间及国际标准化比值

SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测凝血酶原时间和国际标准化比值，其中空白组凝血酶原时间16.7s，国际标准化比值1.04；单用华法林组凝血酶原时间20.1s，国际标准化比值1.42；阿司匹林+华法林组凝血酶原时间23.8s，国际标准化比值1.67，三组比较差异有统计学意义，P<0.05。

2.3 血小板胞内[Ca2+]i测定

SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测凝血酶原时间和国际标准化比值，其中空白组血小板胞内[Ca2+]i （57.6±13.1）nmol/L；单用华法林组血小板胞内[Ca2+]i（43.4±12.5）nmol/L；阿司匹林+华法林组血小板胞内[Ca2+]i（32.6±11.3）nmol/L，三组比较差异有统计学意义，P<0.05。如表1所示。

3 讨论

3.1 华法林

华法林影响外源性凝血因子VII的活性，口服华法林后通过监测其对外源性凝血系统的影响（凝血酶原时间，PT）来调整剂量。临床使用标准化PT，即国际标准化比值（INR）来调整华法林的用药剂量。INR=PTRISI，其中ISI为国际敏感指数，代表凝血活酶的促凝活（敏感性）；PTR为受试者PT与正常血浆PT的比值。

3.2 阿司匹林

ATC研究对不同剂量的阿司匹林在预防严重心脑血管事件方面的疗效进行了荟萃分析，证实阿司匹林的长期使用最佳剂量为75～150mg/d[1]，增加阿司匹林的剂量并不能增强其抗血小板的功效而不良反应增加，剂量过小（<75mg/d）时，疗效不确定。长期服用小剂量（75～150mg/d）阿司匹林，能够获得相对最佳的耐受性和疗效。在急性期，为了快速抑制血小板聚集，应该给予150～300rng负荷剂量，肠溶片剂应该嚼服。

3.3 阿司匹林与华法林联用

从上文中得出的结果所示：SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测定，血小板聚集功能：空白组血小板聚集抑制率0.5%，单用华法林组血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+华法林组血小板聚集抑制率58%，三组比较差异有统计学意义，P<0.05；凝血酶原时间和国际标准化比值：空白组凝血酶原时间16.7s，国际标准化比值1.04；单用华法林组凝血酶原时间20.1s，国际标准化比值1.42；阿司匹林+华法林组凝血酶原时间23.8s，国际标准化比值1.67，三组比较差异有统计学意义，P<0.05。血小板胞内[Ca2+]i测定：空白组血小板胞内[Ca2+]i （67.7±12.9）nmol/L；单用华法林组血小板胞内[Ca2+]i（54.5±11.4）nmol/L；阿司匹林+华法林组血小板胞内[Ca2+]i（43.7±10.9）nmol/L，三组比较差异有统计学意义，P<0.05。可见，阿司匹林与华法林联用，在血小板抑制率，凝血酶原时间和国际标准化比值及血小板胞内Ca2+浓度方面，均优于单用华法林组，两要联用使抗血小板作用与抗外源性凝血途径作用结合，在临床上可以发挥更强的抗凝作用，可以应用于单用华法林无法控制的顽固性高凝状态患者。但是血小板系统及凝血因子的功能同时被抑制，增加了用药后的出血风险，从结果中可以看出，两药联用后，凝血酶原时间显著增加，血小板抑制率大幅上升，当应用于患者身上时，有可能导致患者由高凝状态转变为凝血功能不足，引发出血，甚至危及生命[2]。从本文的结果中，我们可以得知，对于不同药理的药物配伍使用，应当结合具体情况，在使用过程中密切监测患者血液系统指标，以期达到在药物的作用下，患者凝血指标值基本保持在正常范围内。

阿司匹林与华法林的联用已有多年的研究历史，但是由于在临床使用时无法把握好使用的比例和联用时机、时间，导致两药联用受到限制。只要正确的了解阿司匹林与华法林的药理特性，密切监测联用时的血液学凝血系统指标，两药的联用必将成为各类凝血系统亢进疾病的有效治疗方式。

参考文献：

[1]莫卫民，景华，陈冰，等.心脏瓣膜置换病人口服华法林后的对映体药动学研究[J].中国药学杂志，2007，32（3）：52.

[2]陈修，陈维洲，曾贵云.心血管药理学[M].人民卫生出版社，2009：569.