固态发酵制备红曲淮山的工艺优化

任二芳 牛德宝 谢朝敏 苏艳兰 罗小杰 王淋靓 刘功德 李建强

摘要：【目的】优化固态发酵制备红曲淮山工艺，为淮山资源的开发利用提供技术支持。【方法】以淮山为原料，在单因素试验的基础上，以发酵时间、底物量、接种量和培养基初始水含量为考察因素，以色价为评价指标，通过正交试验确定固态发酵制备红曲淮山的最佳工艺，并参照QB/T 2847-2007《功能性红曲米（粉）》和GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》对制备的红曲淮山进行功能成分分析。【结果】影响固态发酵制备红曲淮山的因素排序为底物量>培养基初始水含量>发酵时间>接种量；固态发酵制备红曲淮山的最佳工艺条件：发酵时间13 d、底物量45 g（置于250 mL三角瓶中）、接种量0.4%、培养基初始水含量60%，在此条件下制得的红曲淮山色价均值為1205.42 u/g，降血脂功效成分莫纳科林K和降血压功效成分γ-氨基丁酸含量分别为80.00和31.74 mg/100 g，是发酵前红曲的10.00倍和10.58倍。【结论】淮山代替籼米作为红曲霉的发酵底物，发酵得到的红曲淮山功效成分含量高，为淮山资源的充分利用提供一条新途径。

关键词： 固态发酵；红曲；淮山；色价；正交试验

中图分类号： TS201.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）06-1074-06

Optimization of solid state fermentation preparation for

yam fermented by monascus

Abstract：【Objective】Solid state fermentation preparation for yam fermented by monascus was optimized to provide technical support for yam resources development and utilization. 【Method】Using yam as raw materials， on the basis of single factor test， fermentation time， substrate quantity， inoculation rate and initial moisture content of medium as investigation factors and color value as evaluation index， the optimum solid state fermentation condition for yam fermented by monascus was determined by orthogonal test. According to QB/T2847-2007 Functional Monascus Rice（Powder） and GB/T5009.124-2003 Measure ment of Amino Acid in Food， functional components of yam fermented by monascus was analyzed. 【Result】The order of factors affecting solid state fermentation preparation for yam fermented by monascus was as follows： substrate quantity>initial moisture content of medium>fermentation time>inoculation rate. In addition， the optimal fermentation conditions were： fermentation time 13 d， substrate quantity 45 g（placed in 250 mL triangular flask）， inoculation rate 0.4% and initial moisture content of medium 60%. In this condition， the average color value of yam fermented by monascus reached 1205.42 u/g. The content of functional components for blood lipid reduction Monakelin K was 80.00 mg/100 g， which was 10.00 times of monascus before fermentation. The content of functional components for blood pressure decline γ-aminobutyric acid was 31.74 mg/100 g， which was 10.58 times of monascus before fermentation. 【Conclusion】Using yam as substrate quantity instead of indica rice for monascus， the obtained monascus yam contains high functional components. This study could open up a new way to make full use of yam resources.

Key words： solid state fermentation； monascus； yam； color value； orthogonal experiment

0 引言

【研究意义】红曲又称红曲米，传统红曲是以籼米为原料，经红曲霉发酵而制成的紫红色米曲（毛瑞丰，2003）。红曲中不仅含有红色素，还含有洛伐他汀等多种活性物质，具有降胆固醇、降血糖、降血压等功效；除了应用于酿酒，在腐乳、食醋、食品色素及中药等领域也有广泛应用，对食品工业具有重要价值（张秀媛等，2012）。红曲产地主要分布于我国福建、浙江、广东、江苏、台湾等地，以福建古田红曲最著名（路秀玲等，2001；沈士秀，2001）。目前，国内的红曲米生产大多仍采用传统固态发酵工艺，尽管固态发酵工艺存在种子纯度低、发酵周期较长、生产效率低等缺点，但也具有过程易操作、水活度低、基本无废水及污染物排放等优点（姜冰洁，2015）。淮山是药食两用植物，不仅富含蛋白质、碳水化合物、粗纤维、胡萝卜素、B族维生素、尼克酸、维生素C、钙、磷、铁等营养成分（王蕊，2006），还含有皂苷、多巴胺、胆碱、麦角固醇、植酸等生物活性物质（Alves et al.，2002；Chen and Lin，2007；Huang et al.，2007；Yang and Lin，2008），营养价值高，具有健脾、补肺、固肾、益精、降血糖、降血脂、减少皮下脂肪堆积、调理肠胃等功效，能有效防止结缔组织萎缩，预防发生类风湿关节炎等胶原病（王蕊，2006）。淮山化学成分与籼米相似，两者淀粉含量接近，若能以淮山代替籼米作为红曲霉的发酵底物，不仅使淮山资源得到充分利用，还能充分发挥淮山和红曲的双重保健功效。因此，研究固态发酵制备红曲淮山的工艺条件，对充分开发利用淮山资源具有重要意义。【前人研究进展】陈运中（2003）以早籼米为原料，红曲霉为菌种，研究种子液体发酵和红曲固体发酵生产红曲色素工艺，选育出SM005h优势菌株1株，得到种子液体发酵最佳条件为6%接种量、1∶0.5通气量、搅拌转速350 r/min、31 ℃下培养31 h；红曲固体发酵最佳条件是接种量6%、米饭初始水分含量38%、发酵温度32～35 ℃。高玉荣等（2008）采用Box-Behnken试验设计和响应面优化确定了玉米固态发酵产红曲红色素补加营养物的最佳添加量：葡萄糖0.26%（w/w）、硫酸镁0.43%（w/w）、酵母膏0.25%（w/w），在此条件下红曲红色素红色价为2335.17 u/g，色调为1.69，比未补加营养物时分别提高55.67%和64.08%。刘安军等（2009）以豆粕为原料，利用红曲霉菌株进行固态发酵，豆粕与水的质量比为1∶1时得到的发酵产物质量较高。张秀媛等（2012）以小米为原料，通过正交试验优化得到固体发酵制备张杂谷红曲米最佳工艺条件：150 mL三角瓶中，30 ℃下进行恒温培养，发酵时间14 d、中间加水量8%（接种72 h后每24 h加1次水并摇瓶）、接种量10%、底物量15 g，所得红曲米色价为2618 u/g。由上述研究可看出，红曲可以不同底物原料进行固态发酵。此外，也有一些学者对红曲中莫纳科林K、γ-氨基丁酸等关键活性物质进行研究，如胡珊等（2011）通过筛选获得1株γ-氨基丁酸高产菌MXL-8，该菌在29 ℃、200 r/min摇瓶发酵培养6 d，γ-氨基丁酸产量可达22.373 mg/mL；黄群等（2011）筛选出产莫纳科林K能力达157 mg/L的M3菌株为优势菌株，且在最优条件下发酵液的莫纳科林K质量浓度达354.68 mg/L；上述优势菌株的筛选均通过液态发酵进行。【本研究切入点】目前，有关固态发酵制备红曲淮山工艺方面的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以淮山为原料，通过单因素试验和正交试验探讨固态发酵制备红曲淮山的最佳工艺条件，并测定红曲淮山的功能成分含量，为淮山资源的开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

淮山购自广西利客隆超市中华店；红曲购自古田县生华红曲有限公司；乙醇购自广东省化学试剂工程技术研究开发中心，为分析纯。主要仪器设备：HY101-1A型鼓风电热恒温干燥箱（上海沪越实验仪器有限公司）；YX-280B型手提式压力蒸汽消毒器（江阴滨江医疗设备厂）；SW-CJ-IBU洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；JJ500型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；LRH-250-M霉菌培养箱（广东省医疗器械厂）；HH-S数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 无硫淮山粒制备 清洗淮山并削皮，切成0.5～2.0 cm正方形颗粒后，置于由1.0%氯化钠、0.3%抗坏血酸和0.4%柠檬酸组成的护色液中浸泡2～5 h，然后50～65 ℃烘干，使干燥后的淮山水含量在12%以下，即得无硫淮山粒。

1. 2. 2 固态发酵制备红曲淮山单因素试验

1. 2. 2. 1 发酵时间对固态发酵制备红曲淮山的影响

将无硫淮山粒浸泡于自来水中15 h，使复水后的无硫淮山粒（固态培养基）水含量为55%，常压将其蒸至熟而不烂，冷却后与0.5%（以无硫干淮山粒的重量计，下同）的红曲粉（发酵剂）混匀，取55 g混合物装入250 mL三角瓶中，置于温度32 ℃、湿度65%的培养箱中分别发酵6、7、8、9、10、11、12、13和14 d，然后60 ℃烘干，使红曲淮山水含量在10%以下，打粉并测定色价。

1. 2. 2. 2 底物量对固态发酵制备红曲淮山的影响

将无硫淮山粒浸泡于自来水中15 h，使复水后的无硫淮山粒水含量为55%，常压将其蒸至熟而不烂，冷却后与0.5%红曲粉混匀，分别称取25、35、45、55和65 g混合物装入250 mL三角瓶中，置于温度32 ℃、湿度65%的培养箱中發酵12 d，然后60 ℃烘干，使红曲淮山水含量在10%以下，打粉并测定色价。

1. 2. 2. 3 接种量对固态发酵制备红曲淮山的影响

将无硫淮山粒浸泡于自来水中15 h，使复水后的无硫淮山粒水含量为55%，常压将其蒸至熟而不烂，冷却后分别与0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%的红曲粉混匀，取55 g混合物装入250 mL三角瓶中，置于温度32 ℃、湿度65%的培养箱中发酵12 d，然后60 ℃烘干，使红曲淮山水含量在10%以下，打粉并测定色价。

1. 2. 2. 4 培养基初始水含量对固态发酵制备红曲淮山的影响 分别将无硫淮山粒浸泡于自来水中1/6、1/2、1、15和24 h，使复水后的无硫淮山粒水含量为40%、45%、50%、55%和60%，常压将其蒸至熟而不烂，冷却后与0.5%红曲粉混匀，取55 g混合物装入250 mL三角瓶中，置于温度32 ℃、湿度65%的培养箱中发酵12 d，然后60 ℃烘干，使红曲淮山水含量在10%以下，打粉并测定色价。

1. 2. 3 正交试验设计 在单因素试验的基础上，研究影响固态发酵制备红曲淮山的发酵时间、底物量、接种量和培养基初始水含量4个因素，按L9（34）正交表设计试验。因素水平如表1所示。

1. 2. 4 红曲淮山成分测定 按1.2.1方法制备无硫淮山粒，并采用正交试验得出的最优工艺条件进行固态发酵制备红曲淮山，测定红曲淮山中的功能成分及其含量，与未以淮山为底物发酵的红曲进行对比。参照GB 4926-2008《食品添加剂 红曲米（粉）》测定色价；参照QB/T 2847-2007《功能性红曲米（粉）》测定莫纳科林K含量；参照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》测定γ-氨基丁酸含量。

1. 2. 5 无菌操作 试验用的所有三角瓶、烧杯、钥匙等小器皿均置于121 ℃高压锅中灭菌15 min；移液枪、称量纸等不适宜高压锅灭菌的物品均置于无菌操作台上紫外灭菌30 min；所有操作均在无菌操作室中进行。

1. 3 统计分析

所有试验均重复3次。采用SPSS 22.0對试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 固态发酵制备红曲淮山的单因素试验结果

2. 1. 1 发酵时间对固态发酵制备红曲淮山的影响

由图1可知，发酵前12 d，随着发酵时间的延长，红曲淮山色价不断显著提高（P<0.05，下同），发酵12 d后，色价升高不显著（P>0.05，下同），趋于平缓，红曲淮山发酵基本完成。因此，从经济角度和时间效率考虑，确定12 d为最佳发酵时间。

2. 1. 2 底物量对固态发酵制备红曲淮山的影响 由图2可知，随着底物量的增加，红曲淮山色价整体呈先升高后降低的变化趋势，底物量为55 g时达最大值；当底物量超过55 g后，红曲淮山色价不仅显著降低，在发酵过程中还伴有淮山结块和异味产生现象。说明试验采用的250 mL三角瓶空间有限，底物量的过度增加，会阻止红曲霉呼吸氧气，产生厌氧发酵，使其产色能力降低。因此，确定最佳底物量为55 g。

2. 1. 3 接种量对固态发酵制备红曲淮山的影响 从图3可看出，接种量为0.3%～0.5%时，随着接种量的增加，红曲淮山色价显著升高；当接种量超过0.5%后，随着接种量的继续增加，红曲淮山色价显著下降。说明开始时红曲霉菌接种量小、生长缓慢，发酵起动所需时间长，发酵产物积累较少；当接种量超过0.5%时，红曲霉菌会大量消耗发酵底物中的营养物质用于自身繁殖，使单位体积内的养料和溶氧不足，同时伴有大量代谢废物产生，干扰了自身的正常代谢，而不利于获得所需的次级代谢产物。接种量过高或过低，均不利于红曲淮山的发酵，故确定最佳接种量为0.5%。

2. 1. 4 培养基初始水含量对固态发酵制备红曲淮山的影响 从图4可看出，培养基不同初始水含量影响红曲淮山色价，随着培养基初始水含量的增加，红曲淮山色价呈先升高后降低的变化趋势，在培养基初始水含量为55%时达最大值。说明在固态发酵时，孢子萌发及菌丝生长均需适宜的水分，而固态发酵的最大特点是无游离水，因此发酵底物水含量的变化对微生物的生长及代谢能力会产生重要影响。当发酵培养基初始水含量低时，随着红曲霉菌的生长，产热量增大，淮山粒更加干燥，致使红曲霉菌难以生长，影响发酵效果；当发酵培养基初始水含量过高时，淮山粒易产生黏结成块现象，导致淮山颗粒间的空隙变小，直接影响到基质中的气体交换，从而抑制红曲霉菌在淮山粒上的生长，同时通气不足会导致发酵前期产生较多的乙醇，有明显的酒味。因此，最适的培养基初始水含量为55%。

2. 2 固态发酵制备红曲淮山正交试验结果

由表2的R值可知，4个因素对固态发酵制备红曲淮山影响程度依次为B>D>A>C，即底物量的影响最大，其次为培养基初始水含量和发酵时间，接种量的影响相对较小。直观比较表2的9组试验结果可看出，A3B2C1D3组合发酵所得的红曲淮山色价最高，而比较表2中各因素的K值得出最优工艺组合为A3B1C1D3。此外，由表3可知，各因素对红曲淮山色价的影响均不显著。

将组合A3B2C1D3和A3B1C1D3分别进行多次重复试验，得到红曲淮山色价均值分别为980.23和1205.42 u/g，可确定固态发酵制备红曲淮山的最优工艺组合为A3B1C1D3，即最佳工艺条件为发酵时间13 d、底物量45 g、接种量0.4%、培养基初始水含量60%。

2. 3 红曲淮山功能成分分析结果

参照QB/T 2847-2007《功能性红曲米（粉）》和GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》标准，对采用正交试验优化的固态发酵工艺制备的红曲淮山和未以淮山为底物发酵的红曲分别进行功能成分分析，检测结果如表4所示。通过对比发现，以淮山为底物经发酵后所得的红曲淮山中莫纳科林K和γ-氨基丁酸含量分别为80.00和31.74 mg/100 g，是发酵前红曲的10.00倍和10.58倍。说明淮山营养物质丰富，作为发酵底物可很好地保证红曲霉菌快速繁殖所需的营养供给，而产生更多次级代谢产物（莫纳科林K和γ-氨基丁酸等）。

3 讨论

自20世纪80年代以来，发达国家已采用厚层通风制曲和液态发酵法结合生产红曲，实现了红曲生产的机械化、连续化和自动化，但此方法首期投入性大，技术要求高，在我国尚未大规模推广应用（刘颖，2006）。目前国内的红曲米生产大多仍采用传统的固态发酵工艺，其具有设备构造简单、资本投入小、过程易操作，水活度低、酶系丰富且活力高，发酵过程中不需严格的无菌条件，后处理简便、基本无废水及污染物排放等优点（姜冰洁，2015）。随着时代的发展和科技的进步，人们对红曲的研究日渐广泛且深入，开发高产发酵培养基配方及弥补传统固态发酵技术的不足已成为研究新方向（程哲灏等，2011）。

本研究以淮山代替籼米作为红曲霉的发酵底物，单因素试验结果表明，红曲淮山色价随着发酵时间的延长不断显著升高，12 d后趋于平缓；而随着底物量、接种量和培养基初始水含量的增加，均呈先升高后降低的变化趋势。通过正交试验优化得到固态发酵制备红曲淮山的最佳工艺条件为：发酵时间13 d、底物量45 g（置于250 mL三角瓶中）、接种量0.4%、培养基初始水含量60%，在此条件下得到红曲淮山色价均值为1205.42 u/g，符合GB 4926-2008《食品添加剂 红曲米（粉）》中对于色价的要求。分析4个因素对固态发酵制备红曲淮山的影响程度，发现底物量是主要因素，其次是培养基初始水含量和发酵时间，而接种量影响相对较小。莫纳科林K和γ-氨基丁酸是红曲中的关键活性物质，其中莫纳科林K具有调节血脂、抑制胆固醇、调节人体免疫功能、抑瘤抗癌等功效（熊晓辉等，2004；黄群等，2011）；γ-氨基丁酸具有延缓神经细胞衰老、降血压、治疗精神疾病、预防老年痴呆、抗焦虑、活化肾功能、改善肝功能、防止肥胖等重要的生理功能（胡珊等，2011；党娟等，2015；杨涛等，2015）。本研究制得的红曲淮山中莫纳科林K和γ-氨基丁酸含量均高于未以淮山为底物发酵前的红曲，分别是发酵前红曲的10.00倍和10.58倍。 可见，以淮山代替籼米作为红曲霉的发酵底物具有可行性，不仅能使淮山资源得到充分利用，还可充分发挥淮山和红曲的双重保健功效。

4 结论

淮山代替籼米作为红曲霉的发酵底物，发酵得到的红曲淮山功效成分含量高，为淮山资源的充分利用提供一条新途径。

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（責任编辑 罗 丽）