酶解法提取紫甘薯多糖及其生物活性研究

吴远耀，汪劲松，张新潮，王卫东，潘继承

(湖北师范大学生命科学学院，湖北 黄石 435002)

酶解法提取紫甘薯多糖及其生物活性研究

吴远耀，汪劲松，张新潮，王卫东，潘继承*

(湖北师范大学生命科学学院，湖北 黄石 435002)

紫甘薯匀浆经过木聚糖酶处理、热水浸提、乙醇沉淀、除蛋白、脱色得到紫甘薯粗多糖，通过DEAE-Cellulose阴离子交换柱层析得到4种多糖组分，并对其抗氧化活性进行了研究。结果表明，采用木聚糖酶提取紫甘薯多糖的最适条件为：酶添加量0.02%、酶解时间60 min、酶解温度55 ℃。紫甘薯多糖具有较好的抑制邻苯三酚自氧化活性和清除·OH能力，是一种效果好、安全性高的新型天然抗氧化物质。

酶解法；紫甘薯多糖；木聚糖酶；抗氧化活性

紫甘薯原产于美洲，生长环境宽泛、容易栽培。引种于日本的紫甘薯，其茎叶和根块中除含有各种营养成分外，还含有丰富的花青素和多糖，紫甘薯水提液具有抗突变和抗氧化能力[1]。研究表明，紫甘薯根块具有抗氧化和降血糖的作用，可用于预防心血管疾病和糖尿病，有治疗肝功能障碍等保健功能[2]。多糖的生物活性是目前研究的热点，如抗氧化、抗肿瘤、抗突变、抑菌等。现今多糖的研究多集中在真菌、海洋植物和药用植物上，对日常生活中的果蔬研究较少。由于紫甘薯为甘薯变种，目前大部分研究都围绕甘薯进行[3]，对紫甘薯多糖研究较少。作者以紫甘薯为原料，利用木聚糖酶提取紫甘薯多糖，并研究了其相应的生物活性。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜紫甘薯，市售。

木聚糖酶(酶活≥10 000U·g-1，生化级)，湖北汇特生物医药技术有限公司。

95%乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、98%浓硫酸，均为分析纯。

ORION型pH计，TGL-16LA型高速冷冻离心机，GL-2M型冷冻离心机，BS-1E型振荡培养箱，KDM型调温电热套，分析天平。

1.2 方法

1.2.1 紫甘薯多糖的提取与分离纯化

(1)将紫甘薯去皮、切片、晾干、粉碎，得到紫甘薯粉。

(2)酶处理紫甘薯粉。称取5 g紫甘薯粉，加入40 mL蒸馏水调成匀浆，按一定比例加入木聚糖酶，于55 ℃、200 r·min-1恒温摇床中培养1 h，于75 ℃恒温水浴5 min让酶失活[4]。

(3)酶解液离心取上清液，向其中加入3 倍体积的无水乙醇[5]，4 ℃过夜。

(4)离心，取沉淀，用蒸馏水溶解沉淀。

(5)脱蛋白。配制sevage溶液(氯仿∶正丁醇=4∶1，体积比，下同)；按提取液∶sevage溶液=4∶1(体积比)加入sevage溶液脱蛋白，反复脱5次，每次30 min，充分振荡，离心取上清液[6]。

(6)脱色。活性炭使用前烘干数天。将活性炭按3%的比例加入到提取液中，振荡30 min，6 500 r·min-1离心10 min，反复脱2次至溶液透彻，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液(即粗多糖)，保存至4 ℃冰箱。

(7)采用DEAE-Cellulose阴离子交换柱层析分离纯化粗多糖。将适量处理好的DEAE-Cellulose装柱，用pH值7.4、50 mmol·L-1的PBS缓冲液平衡。将粗多糖上样，分别用0.3 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.8 mol·L-1、2 mol·L-1的NaCl溶液洗脱，流速控制为1.0 mL·min-1，每管收集10 mL。

1.2.2 清除羟基自由基能力的测定[7]

用FeSO4+H2O2产生羟基自由基(·OH)，以氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH的量。反应液中加入多糖200 μL，加入H2O2启动反应，以不加多糖的反应液为对照溶液。测510 nm处的吸光值，多糖对·OH的清除率按式(1)计算：

(1)

式中：A0为对照溶液的吸光值；A1为样品溶液的吸光值。

1.2.3 多糖对邻苯三酚自氧化的抑制作用的测定

取100μL多糖、1.8 mL Tris-HCl缓冲液(0.1 mol·L-1，4 mmol·L-1EDTA，pH值8.2)和1.0 mL双蒸水于反应瓶中，25 ℃水浴保温10 min，加入100μL邻苯三酚(3 mmol·L-1)，混合后每隔30 s测325 nm处的吸光值A325，得出A325随时间的变化曲线，以回归方程的斜率作为邻苯三酚的自氧化速率v(△A·min-1)。以不加多糖的反应液为对照溶液。多糖对邻苯三酚自氧化的抑制率按式(2)计算：

(2)

式中：v0、v1分别为对照溶液和样品溶液的自氧化速率。

1.2.4 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定。标准曲线的绘制：称取恒重的无水葡萄糖0.5 g，溶于500 mL双蒸水中，配制1.0 g·L-1的葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，加蒸馏水补足至1 mL，分别加入5%苯酚1 mL混匀，再加入浓硫酸5 mL，振荡混匀放置30 min。以蒸馏水作为空白对照。以波长490 nm处的吸光值为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 木聚糖酶添加量对紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影响

分别将0.02%、0.06%、0.10%的木聚糖酶添加到紫甘薯匀浆中，固定酶解温度为55 ℃、酶解时间为60 min，考察木聚糖酶添加量对紫甘薯多糖得率(以提取液总糖浓度表示，下同)和·OH清除率的影响，结果如图1所示。

图1 酶添加量对紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影响

由图1可以看出，随着酶添加量的增大，多糖得率(总糖浓度)和酶添加量不呈线性关系。酶添加量为0.02%时，多糖得率最高；在0.02%～0.06%酶添加量范围内，随着酶添加量增大，多糖得率反而明显降低；在0.06%～0.10%酶添加量范围内，随着酶添加量增大，多糖得率上升，这可能是由于可溶性多糖含量相应增加。但是随着酶添加量增大，多糖清除·OH能力下降。这可能是由于具有清除·OH能力的多糖被木聚糖酶降解。

2.2 酶解时间对紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影响

固定酶解温度为55 ℃、酶添加量为0.02%，考察酶解时间对紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影响，结果如图2所示。

图2 酶解时间对紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影响

由图2可以看出，随着酶解时间的延长，多糖得率和·OH清除率逐渐上升；酶解60 min时，多糖得率和·OH清除率均达到最高；酶解时间超过60 min后，多糖得率和·OH清除率均开始下降。原因是，酶解时间太长，超过60 min后，木聚糖酶将粗多糖和木聚糖降解成更小的分子，多糖得率和清除·OH能力受到影响。

2.3 酶解温度对紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影响

固定酶添加量为0.02%、酶解时间为60 min，考察酶解温度对紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影响，结果见图3。

图3 酶解温度对紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影响

由图3可以看出，随着酶解温度的升高，多糖得率和·OH清除率均上升；酶解温度为55 ℃时，多糖得率和·OH清除率达到最高；酶解温度超过55 ℃后，多糖得率和·OH清除率下降。

综上，木聚糖酶处理紫甘薯匀浆提取紫甘薯多糖的最适条件为：木聚糖酶添加量0.02%、酶解时间60 min、酶解温度55 ℃。

2.4 多糖的分离纯化

将处理后的紫甘薯多糖粗提液经DEAE-Cellulose阴离子交换柱分离纯化，依次用0.3 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.8 mol·L-1、2 mol·L-1NaCl溶液洗脱收集组分，根据层析图谱的出峰情况判断所得多糖组分。

图4为用苯酚-硫酸法检测，以波长490 nm处吸光值为纵坐标、收集管数为横坐标绘制的洗脱曲线。

由图4可以看出，洗脱曲线有4个峰，收集相应的组分，得到4个多糖组分，分别命名为PPSP Ⅰ、PPSP Ⅱ、PPSP Ⅲ、PPSP Ⅳ。

2.5 多糖抗氧化活性测定结果

2.5.1 对邻苯三酚自氧化的抑制作用

以缓冲溶液为对照，比较紫甘薯多糖4个组分对邻苯三酚自氧化的抑制作用，结果见图5。

由图5可以看出，多糖PPSP Ⅰ、PPSP Ⅱ、PPSP Ⅲ、PPSP Ⅳ4个组分对邻苯三酚自氧化的抑制率均超过40%，其中PPSP Ⅱ对邻苯三酚自氧化的抑制率达到78%。表明紫甘薯多糖具有较好抗氧化的活性。

图5 4种紫甘薯多糖组分和VC对邻苯三酚自氧化的抑制率

2.5.2 清除羟基自由基能力

·OH是对机体危害最大的自由基。以消除Feton反应产生的·OH量为依据，判断紫甘薯多糖的清除·OH活性。以缓冲溶液为空白对照，以维生素C(VC)为阳性对照，比较紫甘薯多糖4个组分和VC对·OH的清除率，结果见图6。

图6 4种紫甘薯多糖组分和VC对·OH的清除率

由图6可以看出，4个多糖组分展现出不同的清除·OH能力，其中多糖PPSP Ⅰ的·OH清除率可达到VC清除率的一半。

2.5.3 多糖抗氧化性活性分析

紫甘薯多糖各组分对邻苯三酚自氧化的抑制作用和清除·OH活性不同，PPSPⅡ对邻苯三酚自氧化的抑制作用最强，PPSPⅠ对·OH的清除活性最强，所有组分都具有一定的抗氧化活性。导致紫甘薯多糖各组分抗氧化性不同的原因可能是多糖结构不同，多糖链越长、空间结构越紧密，多糖空间结构展开需要温度越高，而多糖空间结构展开越多，抗氧化性越强。

3 结论

采用酶解法提取紫甘薯多糖，确定最佳提取工艺条件为：木聚糖酶添加量0.02%(酶活≥10 000 U·g-1)、酶解时间60 min、酶解温度55 ℃。用DEAE-Cellulose阴离子交换柱层析对紫甘薯多糖进行分离，得到了4种多糖组分。结果表明，紫甘薯多糖在体外具有清除·OH能力和抗氧化作用，为紫甘薯多糖保健品开发提供了依据。

[1] TAYLOR S L.Advances in Food and Nutrition Research[M].New York:Academic Press，2007,52(6):1-59.

[2] 明兴加,李坤培,张明,等.紫色甘薯的生理活性及开发应用研究进展[J].食品研究与开发，2007,28(1):144-147.

[3] 林娟,邱宏端,林霄.甘薯多糖的提取纯化及成分分析[J].中国粮油学报,2003,18(2):64-66.

[4] 刘长江,潘松,梁爽.响应曲面法优化软枣猕猴桃多糖超声辅助提取及乙醇沉淀工艺[J].食品科学,2012,33(2):1-6.

[5] 游雪娇,顾振新.百合非淀粉多糖的除蛋白工艺与抗氧化性研究[J].食品工业,2014，35(7):15-20.

[6] 王彦超.木薯淀粉和甘蔗木聚糖生化特性的研究[D].沈阳：东北农业大学,2009.

[7] 李利华.甘薯多糖超声辅助提取及其抗氧化活性的研究[J].食品工业科技,2012,33(18):257-260.

Enzymolysis Extraction of Polysaccharides from Purple Sweet Potato and Its Biological Activity

WU Yuan-yao，WANG Jing-song，ZHANG Xin-chao，WANG Wei-dong，PAN Ji-cheng*

(CollegeofLife，HubeiNormalUniversity，Huangshi435002，China)

Inthispaper，crudepolysaccharidesfrompurplesweetpotatowereobtainedbymeansofxylanasehydrolysis，hotwaterextraction，ethanolprecipitation，deproteinanddecolorization.ThefourpurepolysaccharideswereharvestedwithDEAE-Celluloseanionexchangechromatography.Inaddition，theirantioxidantactivitywasdiscussed.Theoptimalextractionconditionsofpolysaccharideswereasfollows:xylanasedosageof0.02%，enzymolysistimeof60min，enzymolysistemperatureof55 ℃.Polysaccharidesfrompurplesweetpotatoshowedhigherinhibitionactivityforpyrogallolauto-oxidationandscavengingrateon·OH，andtheycanbeusedaseffectiveandsafenaturalantioxidants.

enzymolysis;polysaccharidefrompurplesweetpotato；xylanase；antioxidantactivity

2016-12-17

吴远耀(1988-)，男，湖北鄂州人，硕士研究生，研究方向：生物大分子，E-mail:741917544@qq.com；

潘继承，教授，E-mail:992708747@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.012

O629.12

A

1672-5425(2017)03-0049-04

吴远耀，汪劲松，张新潮，等.酶解法提取紫甘薯多糖及其生物活性研究[J].化学与生物工程，2017，34(3)：49-52.