酶-微波联用法提取枸杞总黄酮

孙昊，牛红军，王芃

（天津现代职业技术学院，天津300350）

酶-微波联用法提取枸杞总黄酮

孙昊，牛红军，王芃*

（天津现代职业技术学院，天津300350）

研究酶-微波联用法提取枸杞总黄酮的最佳工艺条件。采用纤维素酶提取枸杞总黄酮，在单因素试验基础上利用正交试验研究乙醇浓度、酶解温度和酶解pH值对提取率的影响，确定最佳酶解条件。在单因素试验基础上，通过正交试验确定微波提取的最佳工艺参数，采用微波法进一步提取酶解液中的枸杞总黄酮。酶解阶段最佳工艺参数为：乙醇浓度45%，酶解温度50℃，酶解pH4.0；微波阶段的最佳工艺参数为：液固比30 mL/g，微波温度65℃，微波时间4 min。该酶-微波联用法提取枸杞总黄酮的提取率达1.560%。

枸杞子；总黄酮；纤维素酶；微波

枸杞子是传统药食两用植物枸杞的干燥成熟果实，性甘，味平，归肝、肾经。随着研究深入，其应用价值逐渐显现，在食品、保健品和医药中的应用引起了重视，已形成综合利用枸杞的产业链[1]。枸杞总黄酮是枸杞子中重要的活性物质之一[2]，药理学研究表明其具有降低血糖、抗脂肪肝、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗抑郁和抑制肿瘤等[3-6]功能。

目前，提取枸杞总黄酮的方法主要有微波辅助提取法、索氏提取法和超声提取法等[7-9]，具有所需设备简易和操作简单等优点，但枸杞总黄酮提取率仍有待提高。纤维素和半纤维素等是植物细胞壁的主要成分，纤维素酶能破坏细胞壁，利于枸杞总黄酮向胞外扩散，提高提取率，利用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等提取活性成分的酶法是一种新型提取方法。微波提取具有提取效率高、杂质少和溶剂用量少等特点。已有将酶法和微波法共同使用的酶-微波联用法用于提取中药材中黄酮的报道[10]。本试验利用酶-微波联用法对提取枸杞总黄酮的工艺进行研究，经单因素试验和正交试验得到了提取枸杞总黄酮的最佳提取条件，为提高枸杞总黄酮提取率，进一步促进枸杞子中黄酮的应用提供了参考。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂

枸杞：产自宁夏中宁，干燥、粉碎，过筛取60目～80目枸杞粉，备用；芦丁标准品（纯度＞98%）：上海圻明科技有限公司；纤维素酶（400 U/mg）：南京奥多福尼生物科技有限公司；亚硝酸钠、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器

UV-1800PC型紫外/可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；MAS-II型常压微波合成/萃取反应工作站：上海新仪微波化学科技有限公司；ME204E型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；GZX-9070MBE型电热鼓风干燥箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 提取工艺及优化

称量适量枸杞粉，以石油醚为溶剂索氏除脂，干燥。定量加入一定浓度的乙醇溶液和一定量的纤维素酶，控制酶解温度和溶液pH值，酶解一定的时间制得枸杞酶解混合物，真空抽滤，得酶法枸杞总黄酮提取液，测定其总黄酮浓度，得出总黄酮提取率。以总黄酮提取率为评价指标，分别对纤维素酶用量、乙醇浓度、液固比、酶解温度、酶解pH值和酶解时间进行单因素试验，并应用正交试验优化酶法提取的工艺。

参照以上优化后的酶解方案制备酶法枸杞总黄酮提取液，调整液固比，设定微波温度，微波辅助提取一定时间后，趁热真空抽滤，收集滤液，得酶-微波联用法枸杞总黄酮提取液，测定总黄酮浓度，得出总黄酮提取率。以总黄酮提取率为评价指标，分别对微波温度、微波时间和液固比进行单因素试验，并应用正交试验优化微波提取阶段工艺。

2.2 标准曲线的绘制

精密称取干燥至恒重芦丁标准品5 mg于50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，配制浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。精确量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准溶液，分别移入10 mL容量瓶，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液0.3mL，摇匀，放置6min；再加入4%NaOH溶液4.0mL，用60%乙醇定容，摇匀，放置15 min。在510 nm波长处测定溶液的吸光度。以芦丁质量浓度X（mg/mL）为横坐标，吸光值Y为纵坐标，得到标准曲线，其回归方程为Y=10.870X+0.007 1，R=0.999 2。

2.3 样品中总黄酮提取率的测定

准确移取1 mL适当稀释后的提取液至10 mL容量瓶中，参照项目2.2采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法显色，定容。在510 nm处测定吸光值，根据标准曲线回归方程计算总黄酮质量浓度，并计算总黄酮提取率。

2.4 酶解提取阶段条件的优化

2.4.1 单因素试验

2.4.1.1 酶用量对总黄酮提取率的影响

取2 g枸杞粉，以液固比25 mL/g加入50%乙醇溶液，分别加入质量分数为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的纤维素酶，在pH4.5，45℃条件下酶解2 h，结果见图1。

图1 酶用量对总黄酮提取率的影响Fig.1Effect of enzyme dosage on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

总黄酮提取率随酶用量增加而显著增大，酶用量达0.3%时提取率为1.09%，之后，酶用量继续增加对提取率影响不再显著，综合提取率和成本因素考虑，酶用量为0.3%较适宜。

2.4.1.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

取2 g枸杞粉，以液固比25 mL/g加入体积分数为40%、45%、50%、55%和60%的乙醇溶液，加入质量分数为0.3%的纤维素酶，在pH4.5，45℃条件下酶解2 h，结果见图2。

图2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.2Effect of enzymolysis ethanol concentration on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

乙醇浓度增加，总黄酮提取率提高，当乙醇浓度50%时达到最大值，之后显著降低。可能是由于枸杞总黄酮极性较大，乙醇浓度过高导致极性降低反而不利于总黄酮溶解。

2.4.1.3 液固比对总黄酮提取率的影响

取2 g枸杞粉，分别以液固比15、20、25、30、35 mL/g加入不同体积的50%乙醇溶液，加入质量分数为0.3%的纤维素酶，在pH4.5，45℃条件下酶解2 h，结果见图3。

图3 液固比对总黄酮提取率的影响Fig.3Effect of enzymolysis liquid-solid ratio on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

加大溶剂体积，能使溶剂中总黄酮维持低浓度，使枸杞粉与溶剂中总黄酮有较大的浓度差，利于总黄酮溶出。随着溶剂量增加，总黄酮溶出已较充分，即使继续加大溶剂体积也无法持续使总黄酮提取率提高，结合节约溶剂的需要，认为液料比20 mL/g较适宜。

2.4.1.4 酶解温度对总黄酮提取率的影响

取2 g枸杞粉，以液固比20 mL/g加入50%乙醇溶液，加入质量分数为0.3%的纤维素酶，pH4.5条件下，分别35、40、45、50、55、60℃酶解提取2 h，结果见图4。

图4 温度对总黄酮提取率的影响Fig.4Effect of enzymolysis temperature on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

温度对总黄酮提取率影响显著，当酶解温度为50℃时，总黄酮提取率明显较高，表明50℃为酶的最佳酶解温度，枸杞细胞壁破坏效果较好，利于总黄酮溶出。

2.4.1.5 酶解pH值对总黄酮提取率的影响

取2 g枸杞粉，以液固比20 mL/g加入50%乙醇溶液，加入质量分数为0.3%的纤维素酶，分别在pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0条件下，50℃酶解提取2 h，结果见图5。

图5 pH值对总黄酮提取率的影响Fig.5Effect of enzymolysis pH on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

pH4.0时，总黄酮提取率最高，表明复合酶在pH4.0溶液中活性最大，利于总黄酮溶出。随着pH值增大，酶的酶解能力下降，不能较好破坏细胞壁结构，总黄酮提取率降低。

2.4.1.6 酶解时间对总黄酮提取率的影响

取2 g枸杞粉，以液固比20 mL/g加入50%乙醇溶液，加入质量分数为0.3%的纤维素酶，在pH4.0，50℃条件下分别酶解提取1、1.5、2、2.5、3 h，结果见图6。

图6 酶解时间对总黄酮提取率的影响Fig.6Effect of enzymolysis time on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

随着酶解时间增加，提取率随之明显提高，时间大于2 h后提高缓慢，提取3 h仅比2.5 h提取率高0.02%。结果表明，适当延长提取时间利于总黄酮的提取，但当达到2.5 h时提取已较充分，即使延长提取时间也不能明显提高提取率，从节约生产时间考虑，2.5 h为较适宜的提取时间。

2.4.2 正交试验

根据单因素试验结果，选取对提取率影响较大的因素：乙醇浓度、酶解温度和酶解pH值，以总黄酮提取率作为考察指标，设计L9（34）正交试验，确定最优的酶解提取工艺。因素水平见表1，试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交试验因素及水平表Table 1Factors and levels of orthogonal experiment

表2 酶解提取正交试验Table 2Design and results of orthogonal experiment of enzymatic hydrolysis phase

表3 方差分析结果Table 3The results of variance analysis

由表2和表3可知，各因素对枸杞总黄酮提取率的影响大小次序为：酶解pH值＞酶解温度＞乙醇浓度，其中酶解pH值和酶解温度有显著影响。最佳的提取工艺条件为A1B2C2，即乙醇浓度45%，酶解温度50℃，酶解pH4.0。

2.4.3 验证试验

按照优化得到的最佳酶解提取工艺提取枸杞总黄酮，重复3次。该提取工艺较稳定，得率分别为1.378%、1.376%和1.401%，平均值为1.378%。即酶法提取枸杞总黄酮的提取率达1.378%。

2.5 微波阶段提取条件的优化

2.5.1 单因素试验

2.5.1.1 微波时间对总黄酮提取率的影响

设定微波温度为60℃，取酶法枸杞总黄酮提取液，添加45%乙醇至液固比25 mL/g，分别微波辐射2、3、4、5、6 min，考察微波辐射时间对总黄酮提取率的影响，结果见图7。

图7 微波时间对总黄酮提取率的影响Fig.7Effect of time on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

当微波4min时，提取率最高，之后下降。说明微波作用促进了总黄酮溶解，但微波作用时间过长可能对总黄酮造成破坏，故4 min为较适宜的微波提取时间。

2.5.1.2 微波温度对总黄酮提取率的影响

取酶法枸杞总黄酮提取液，添加45%乙醇至液固比25 mL/g，分别设定微波温度为55、60、65、70、75℃，微波辐射4 min，考察微波温度对总黄酮提取率的影响，结果见图8。

图8 温度对总黄酮提取率的影响Fig.8Effect of temperature on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

随着微波温度升高，总黄酮提取率不断增大，65℃总黄酮提取率达最大值。当温度继续升高时，提取率下降，可能温度过高导致总黄酮被破坏，提取所得总黄酮量减少。因此，65℃为较适宜的微波提取温度。

2.5.1.3 液固比对总黄酮提取率的影响

设定微波温度为65℃，取酶法枸杞总黄酮提取液，以45%乙醇将液固比分别调整为20、25、30、35、40 mL/g，微波辐射4 min，考察液固比对总黄酮提取率的影响，结果见图9。

图9 液固比对总黄酮提取率的影响Fig.9Effect of liquid-solid ratio on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

随着溶剂量增加，提取率呈先增大、后减小的趋势。25 mL/g时提取率最高，当溶剂体积继续增大时，提取率下降，可能是溶剂量过大导致微波衰减，提取效果变差。因此，25 mL/g为较适宜的液固比。

2.5.2 正交试验

根据单因素试验结果，以总黄酮提取率作为考察指标，对液固比、微波温度和微波时间3个因素设计L9（34）正交试验，确定最优的微波提取工艺。因素水平见表4，试验结果见表5，方差分析结果见表6。

表4 正交试验因素及水平表Table 4Factors and levels of orthogonal experiment

表5 酶-微波联用法微波提取阶段正交试验Table 5Design and results of orthogonal experiment

表6 方差分析结果Table 6The results of variance analysis

由表5和表6可知，各因素对微波提取阶段枸杞总黄酮提取率的影响大小次序为：液固比＞微波时间＞微波温度，其中液固比和微波时间有显著影响。最佳的提取工艺条件为A3B2C2，即液固比30 mL/g，微波温度65℃，微波时间4 min。

2.5.3 验证试验

按照优化得到的最佳微波提取阶段工艺参数提取枸杞总黄酮，重复3次。得率分别为1.562%、1.563%和1.556%，平均值为1.560%，优化所得工艺参数有效、稳定。即优化的酶-微波联用法所提取枸杞总黄酮的提取率达1.560%。

2.6 比较试验

参照2.5优化得到的微波阶段的最佳提取工艺，取2 g枸杞粉，加入45%乙醇溶液，以液固比30 mL/g浸泡2.5 h后，在65℃，微波提取4 min，制得微波法枸杞总黄酮提取液。重复3次，枸杞总黄酮的提取率分别为1.10%、1.12%和1.09%，平均值为1.10%，即微波法提取枸杞总黄酮的提取率为1.10%。

结果表明，酶-微波联用法提取枸杞总黄酮的效率明显高于微波法和酶法。

3 结论

1）在单因素试验和正交试验基础上优化酶法提取枸杞总黄酮的工艺参数，并进一步优化得到酶-微波联用法提取枸杞总黄酮的工艺参数。得出酶解阶段最佳工艺参数为：乙醇浓度45%，酶解温度50℃，酶解pH4.0；微波阶段的最佳工艺参数为：液固比30 mL/g，微波温度65℃，微波时间4 min。该酶-微波联用法能使枸杞总黄酮提取率达1.560%。

2）比较酶-微波联用法、酶法和微波法3种提取方法对枸杞总黄酮提取率的影响，结果发现酶-微波联用法提取率最高，比酶法和微波法分别增加了13.2%和42%。因此，酶-微波联用法是一种较好的提取枸杞总黄酮方法，能很好地用于制备枸杞总黄酮。

[1]王红利,张立.枸杞中黄酮类化合物的提取及测定方法研究进展[J].饮料工业,2014,17(8)：54-57

[2]葛邦国,刘志勇,朱风涛,等.枸杞加工研究现状与前景展望[J].食品研究与开发,2014,35(4)：93-99

[3]C C Wang,S C Chang,B Stephen Inbaraj,et al.Isolation of carotenoids,flavonoids and polysaccharides from Lycium barbarum L.and evaluation of antioxidant activity[J].Food Chemistry,2010, 120(1)：184-192

[4]王长江.枸杞叶总黄酮对抑郁模型小鼠抗抑郁作用研究[D].兰州：兰州大学,2015

[5]Huang Y,Tan A,Shen Y,et al.Scavenging effect of total flavonoids of lycium barbarum L.on active oxygen radicals and inhibitory effects on heat output from L1210 cells[J].Wei Sheng Yan Jiu,1998, 27(2)：109-111,115

[6]张东涛,张旭,郝秀静,等.宁夏枸杞总黄酮对人胃癌SGC-7901细胞增殖及细胞凋亡的影响[J].时珍国医国药,2014(11)：76-79

[7]杨丽,李雪莲,陈鸿平,等.星点设计-效应面法优化枸杞总黄酮提取工艺[J].中药与临床,2015,6(1)：25-29

[8]罗永,曾雪花.枸杞子不同浓度乙醇提取物中总黄酮含量比较研究[J].安徽医学,2011,32(5)：646-649

[9]吴韶梅,哈婧,冀亚敏.枸杞总黄酮的提取及抗氧化作用研究[J].中国食品添加剂,2013(5)：133-137

[10]丁利君,黄泽华.微波-纤维素酶联合提取芒萁黄酮及抗氧化研究[J].食品科技,2011,36(1)：173-176

Study on Extraction of Total Flavonoids in Lycium barbarum L.with the Enzyme-Microwave Extraction Method

SUN Hao，NIU Hong-jun，WANG Peng*
（Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China）

To research the extract process of total flavonoids in Lycium barbarum L.with the enzyme-microwave extraction method.The effects of ethanol concentration，enzymolysis temperature and enzymolysis pH on the extraction rate of total flavonoids were studied by orthogonal experiment based on single factor experiment.Then enzyme hydrolysate were extracted by microwave method on the optimum technological parameters determined by single factor experiment and orthogonal experiment.The optimum extraction conditions of enzymatic hydrolysis phase was ethanol concentration 45%，temperature 50℃，pH4.0.The optimum extraction conditions of microwave phase was liquid-solid ratio 30 mL/g，temperature 65℃，time 4 min.The extraction rate of total flavonoids in Lycium barbarum L.was 1.560%under the optimum extraction conditions of cellulase-microwave extraction method.

Lycium barbarum L.；total flavonoids；cellulase；microwave

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.019

2016-08-20

天津市教育考试“十三五”科研规划2016年度重点课题（AC2016003）

孙昊（1982—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：化学工艺与流程。

*通信作者：王芃（1964—），女，教授，硕士，研究方向：食品生物技术。