微生物脂肪酶的研究进展及其在饲料中的应用

杨玉静

（南阳市兽药监察所，河南南阳473000）

微生物脂肪酶的研究进展及其在饲料中的应用

杨玉静

（南阳市兽药监察所，河南南阳473000）

脂肪酶，又称三酰甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，作为一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、制革、饲料、洗涤、油脂化工等传统的工业领域。自1984年，Zaks和Klibanov在有机溶剂体系中，以脂肪酶粉为催化剂，成功地催化合成了一系列有机化合物之后，非水相酶学的研究序幕被揭开，并迅速成为应用酶学研究中最为活跃、发展最为迅速的领域。而脂肪酶是非水相酶学中最为重要的一类酶，它显著不同于在水相体系中的水解反应特性，在非水相体系中具有良好的酯化、转酯、醇解和胺解等特性，该特性使脂肪酶可被广泛地应用于生物能源（生物柴油）、药物合成等应用前景广阔的领域。

脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中。动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织等，植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子。而微生物脂肪酶则广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，由于其种类多，且具有比动植物脂肪酶更广的pH值、温度适应性以及底物专一性，并且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此自20世纪初首次发现以来，便得到广泛研究和应用，是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。

1 微生物脂肪酶的种类

据统计，大约有2%的微生物产脂肪酶，至少包括65个属的微生物，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属，且不同微生物来源的脂肪酶组成成分、理化特性各不相同。高产脂肪酶菌株多来源于细菌、酵母菌和霉菌，已开展深入研究的脂肪酶产生菌种主要有根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌等具有工业应用价值的菌种，以及与医学相关的金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体、粉刺状杆菌等。

1.1 细菌脂肪酶

细菌脂肪酶是大规模商业化生产中很重要的一类脂肪酶。细菌脂肪酶大多数是胞外酶，易于液体深层发酵，生产比较容易。细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶，且pH值在4～11、温度30～60℃间具有良好的稳定性。大多数细菌脂肪酶是糖蛋白，但也有些细菌胞外脂肪酶是脂蛋白。细菌脂肪酶发酵生产主要受温度、pH值、碳氮源、脂类物质、无机盐、搅拌和溶解氧浓度等因子的影响。细菌脂肪酶的生产培养基一般是由有机氮源和油脂性的碳源组成，如：油、脂肪酸、甘油和吐温等。通常，脂肪酶生产的温度范围为20～45℃，诱导时间从几小时到3～4 d不等，但是大多数集中在72～92 h间。目前一些属细菌的野生菌或重组菌株得到了商业开发，其中最重要的是无色杆菌，产碱杆菌属、芽孢杆菌属、色杆菌属和假单胞菌属等。

1.2 真菌脂肪酶

真菌脂肪酶的研究开始于20世纪50年代，但由于真菌脂肪酶具有温度和pH值稳定性、底物特异性以及在有机溶剂中具有高活性，提取成本比较低等优点，发展迅速。目前商业化的真菌脂肪酶主要有：黑曲霉、米曲霉、高温毛壳酶、少根根霉、德氏根霉、日本根霉、米根霉、皱褶假丝酵母、南极假丝酵母、柱状假丝酵母等。

2 脂肪酶的结构与性质

2.1 脂肪酶的结构

脂肪酶是一种糖蛋白，糖基部分约占总分子量的2%～15%，以甘露糖为主。酶分子由亲水区和疏水区两部分组成，活性中心靠近疏水端。研究表明，来源不同的脂肪酶，其氨基酸组成数目从270～641不等，分子量为29 000～100 000。

Brockerhoff研究了10种脂肪酶的三维结构，并比较了21种脂肪酶的区域选择性，提出了脂肪酶在油界或水界面定向作用的假设模型。结果表明：①脂肪酶都包括同源区段His-X-Y-Gly-Z-Ser-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly（X、Y、Z、W表示可变氨基酸残基）；②活性中心是丝氨酸残基。在正常情况下，该残基受一个α-螺旋盖的保护，当脂肪酶与油界或水界面接触时，此盖打开，露出疏水残基团，隐藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域，引起脂肪酶的构象改变，增加了酶与脂类底物的亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活。

2.2 脂肪酶的性质

脂肪酶的催化反应特性主要包括最佳温度与pH值、温度与pH值稳定性、水解位点专一性与底物脂肪酸种类专一性等几个方面。微生物脂肪酶一般易溶于水，不溶于乙醇，通常在pH值3.5～7.5之间水解能力较强，部分脂肪酶在pH值2.0时仍有稳定的活性，最适酶解温度在38～45℃之间。

水解位点专一性对于脂肪酶的工业应用是极为重要的，因此对多种脂肪酶的位点专一性做了详细研究。脂肪酶对脂肪酸中立体对映结构1位和3位具有选择性水解能力。例如：Penicilliumsp1和Mucormiehei脂肪酶为1位和3位专一水解酶。有些脂肪酶对底物的脂肪酸组成也具有高度专一性，可对不同碳链长度和饱和脂肪酸表现出不同反应性，不同来源脂肪酶水解不同甘油酯所表现出脂肪酸特异性极大，来源于葡萄孢属的一种脂肪酶对长链不饱和脂肪酸和亚油酸具有专一性，而Fusariumoxysporum脂肪酶则优先水解饱和脂肪酸链。

脂肪酶的催化特性还表现为，在油界或水界面上催化活性最高，在油界或水界面被激活的比率（即水解活力）是单一脂相中的10倍以上。油界或水界面的理化特性在很大程度上决定了一些脂肪酶在界面的吸附，磷脂和胆酸盐等两亲物质能明显影响界面的理化特性。当存在两亲物质时，甘油三酯或水界面的亲水或疏水平衡被打破，辅因子（两亲物质）结合在脂肪酶的特定位点，并通过其疏水端吸附在油/水界面上，使脂肪酶活性中心周围的保护盖被打开，实现界面激活作用。

3 脂肪酶产生菌的筛选及鉴定

脂肪酶的筛选方法一般为：样品-富集培养-平板分离-平板初筛（观察透明圈大小）-摇瓶复筛（测酶活力大小）。已发现的微生物的作用条件因菌种的不同差异很大，不同的筛选方法对被分离的微生物种类及酶的特异性有相当大的影响，因此筛选分离脂肪酶产生菌的方法应根据应用对象、微生物种类、酶的特性而定，最常用的方法是用含有甘油三酯的琼脂平板，脂肪酶催化水解产生清晰的环带或浑浊的脂肪酸盐沉淀，也可利用生色底物或产脂肪酶微生物的某些特性。Fager规定优良产酶菌株的标准应是短时、营养基质低廉、菌株易分离、胞外酶、非致病菌、不产生毒素、遗传性状稳定及对噬菌体不敏感等。目前，产脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉及假单胞菌等。

脂肪酶的筛选方法着眼于快速、简捷、准确、选择性强及易于自动化。20世纪80年代以来，我国研究者在脂肪酶产生菌的选育方面也做了较多的工作。王美英、陶文沂等采用类似的油脂同化平板，以油脂为唯一碳源，进行同化试验，分别筛选到较高活力的菌株。金其荣等以氢化油为唯一碳源，36℃培养，筛选到一株耐高温的根霉菌。施巧琴利用脂肪酶作用脂肪后产生脂肪酸与维多利亚蓝反应呈蓝绿色的透明圈平板法经摇瓶发酵复筛得到产碱性脂肪酶的扩展青霉。

近年来，随着生物工程的发展，分子生物学相关技术在脂肪酶产生菌的筛选、鉴定、诱变和基因克隆等方面也取得了一些进展。燕清丽等，董明奇等分别利用16srRNA技术对脂肪酶产生菌的筛选及鉴定进行了相关研究。

4 微生物脂肪酶的固定化

固定化脂肪酶是指被限定于空间某一区域内的脂肪酶，它有利于提高酶的稳定性并可回收重复利用，便于连续化生产，因此被广泛采用。

脂肪酶固定化方法有四大类：共价结合法、交联法、吸附法（超滤膜吸附法）、包埋法。

4.1 共价结合法

共价结合法是指酶蛋白分子上功能基和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接，结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。共价结合法是固定化酶研究中最活跃的一类方法。

4.2 交联法

交联法的主要特色是用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的交联，基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：①单独与酶作用；②辅助蛋白质与酶共存时，多功能团试剂交联；③酶吸附在载体表面上再经受交联；④多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体，再连接酶。最常用的交联试剂是戊二醛。这类方法的优点是酶与载体结合牢固、不易脱、稳定性较高、试剂价格低廉、固定化成本低；缺点是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时，易造成酶失活，此类方法是固定化酶研究中最有潜力的方法。

4.3 吸附法

吸附法包括物理吸附和离子吸附，主要依靠蛋白质和载体间的结合力联结，作用力较弱，酶易脱落，但载体选择范围较广，固定化操作过程简单，吸附法是经济上最具吸引力的固定化方法。

4.4 包埋法

包埋法是一种酶物理包埋在高聚物内，反应条件温和，很少改变酶结构的固定化方法，适用于大多数酶、酶制剂及完整的微生物细胞，但只有小分子的底物和产物条件下适用。由于采用包埋法固定化酶，酶被完全地限制在微囊或凝胶内，本身的性能根本不发生变化，因此，包埋法是固定化酶研究中最有前景的方法。

国内外学者针对脂肪酶的固定化开展了一系列的研究，1983年，日本学者利用微孔膜生物反应器连续法合成甘油酯；1986年，美国学者Taylor利用系列反应器水解硬脂；1989年，HaraidssonG也是在BsTRs中以鱼肝油DHA，EPA为底物吸附法同定脂肪酶进行酯换；1993年，ward等人以谷物油、橄榄油、花生油中富集的ω-3PUFA为底物，在BsTRs中以离子交换法固定脂肪酶催化酯交换。最近有人报道了脂肪酶固定化的一种新方法，用温和的氧化剂（高碘酸钠）氧化CandidaRugesaLipaser的糖基部分及使其产生醛基，并结合到含有氨基的尼龙载体上，实现固定化。结果使该酶活力提高4倍以上，但固定化后稳定性如何未做报道。

5 微生物脂肪酶在饲料中的应用

脂肪在畜禽体内的作用主要是氧化供能，它含有的能量是碳水化合物的2.25倍，可满足动物体对较高能量浓度的要求。脂肪是脂溶性维生素和某些激素的溶剂，促进对这些物质的吸收和利用，同时为畜禽提供必需的不饱和脂肪酸，保证畜禽的健康生长；添加脂肪还可减少饲料加工过程中的粉尘，改善饲料外观，在高温条件下，还有利于提高能量摄入量，降低畜禽的体热增耗，减缓热应激；此外，添加脂肪可有效地提高饲料的适口性。因此，在猪、鸡和奶牛饲料中添加脂肪是比较普遍的做法。

脂肪酶是脂肪代谢最基本的酶，若缺乏将会影响畜禽机体健康。单胃动物自身能够分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等内源性酶，但是，幼畜、幼禽由于消化机能尚未发育健全，内源性消化酶分泌量不足，限制了其对饲料的利用，所以在幼畜、幼禽日粮中添加外源性的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，能补充体内内源酶的不足，提高动物的生产性能。

5.1 脂肪酶在禽饲料中的应用

家禽出壳时胰腺脂肪酶活性很低，随着日龄增长，其活性逐渐升高。Freeman报道，肉鸡出壳时对动物脂肪的消化率很低，1～8周龄期间逐渐升高。刚出壳时胰腺脂肪酶分泌不足可能是限制禽类脂肪消化率的重要原因之一。Knarreborg等研究了鸡体外和体内胰脂肪酶活性与非共轭胆汁酸，以及肠道pH值间的相互关系，结果表明，非共轭胆汁酸能明显地抑制脂肪酶的活性，而且具有pH值依赖性。

5.2 脂肪酶在猪饲料中的应用

仔猪断奶后，食物由母乳转变为以植物为主的饲料，消化系统不能及时适应，加之仔猪断奶后内源消化酶分泌量普遍下降，需要2～3周才能逐渐恢复，所以，仔猪在早期断奶后常出现下痢、生长迟缓、饲料转化率下降、精神萎靡和抗病力降低等现象，称为“仔猪早期断奶综合征”。添加外源脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶等消化酶被认为是缓解仔猪断奶营养应激的有效手段，国内外已有较多的相关试验报道。

Dierick等用4种中链脂肪（C6：0～C12：0）和6种脂肪酶，在模拟胃环境（37℃，pH值3～6，3 h）下的组合水解试验表明，适量添加脂肪酶能部分释放中链脂肪酸，这些中链脂肪酸对一些消化道要害微生物的生长具有显著的抑制作用，起到类似抗生素的作用。由此推测，脂肪和脂肪酶的合理组合可能起到降低仔猪饲料中抗生素使用量的作用。

6 小结

添加脂肪酶有利于补充特殊生理阶段动物内源消化酶的不足，提高饲料脂肪的消化，缓解营养应激，促进动物生长，但饲料中添加脂肪酶也会加快脂肪水解速度，降低饲料的贮藏稳定性。而已实现商品化生产的脂肪酶多是微生物脂肪，它们的pH值稳定性多在中性偏碱范围内，对酸的耐受力较差，而添加于饲料中的脂肪酶必须经过胃肠道的酸性条件来到达内源酶的水解作用位点，并且还要在作用位点的pH值范围内保持较高的活性，所以绝大多数实现商品化生产的脂肪酶在饲料中的应用还需要进行更深层次的研究，从而来推动脂肪酶在饲料工业中的应用。