3种诱抗剂对凤丹抗病害的诱导效果

缪福俊, 安曼云, 华 梅, 王 毅, 原晓龙, 陈 剑, 王 娟

(1.云南省林业科学院，云南省森林植物培育与开发利用重点实验室/国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南 昆明 650201;2.云南经济管理学院工程学院，云南 安宁 650106)

3种诱抗剂对凤丹抗病害的诱导效果

缪福俊1, 安曼云2, 华 梅1, 王 毅1, 原晓龙1, 陈 剑1, 王 娟1

(1.云南省林业科学院，云南省森林植物培育与开发利用重点实验室/国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南 昆明 650201;2.云南经济管理学院工程学院，云南 安宁 650106)

分别用5个浓度的3种诱抗剂(Harpin、BTH和SA)喷施凤丹叶面，并以清水处理为对照，统计叶片病斑面积和病叶数，从而测定诱抗剂对凤丹抗3种主要病害(红斑病、灰霉病和黑斑病)的诱导效果；同时，测定了最适浓度诱抗剂对3种病原菌的抑制活性，以及对凤丹植株生理指标的影响.结果表明：3种诱抗剂均可有效地诱导凤丹对不同病害产生抗性，其中，BTH的诱抗效果最佳；3种诱抗剂对凤丹抗主要病害的诱导效果均表现为红斑病>黑斑病>灰霉病；诱抗剂处理显著提高了凤丹植株可溶性蛋白和色素含量及相关酶活性，显著降低了超氧阴离子自由基和丙二醛的含量；诱抗剂对凤丹3种病害的病原菌无毒杀作用，但可诱导植株获得系统抗性.

凤丹; 诱抗剂; 诱抗效果; 系统获得性抗性

牡丹是原产于我国的特有生物资源，具有极高的观赏和药用价值，且油用牡丹产业化的发展已上升到国家战略资源的需求[1-2].其中，凤丹(Paeoniaostii)是重要的药用牡丹种类，也是极具潜力的油料作物新资源，又是观赏牡丹嫁接的优良砧木，在牡丹种苗产业化生产中具有十分重要的地位[3].近年来，随着全国各地大规模的种植，其病害问题日益突出，严重影响了其产业化的发展[4].牡丹病害高达30余种，其中，红斑病(Cladosporiumpaeoniae)、灰霉病(Botrytispaeoniae)和黑斑病(Alternariaalternata)已成为危害凤丹的3种常见病害，其主要危害叶片，严重时导致大量苗木死亡[5-6].然而，在这些病害的防治过程中，多采用化学农药，由此带来了环境污染、农药残留、抗药性等问题.植物病害诱抗剂的出现，为凤丹病害的防治提供了一条可行的途径[7-8].植物病害诱抗剂也叫植物疫苗，是一类小分子有机化合物的新型生物农药，具有抗病谱广、持续时间长、对人畜无害、不污染环境、抗病性表达时间和空间可控等优点.通过诱导植物获得系统抗性(systemic acquired resistance,SAR)，已成为当前的研究热点[9-10].

李芳等[11]研究发现，植物诱抗剂对番茄灰霉病和早疫病病原菌的生长具有抑制效果.左应梅等[12]研究了4种诱抗剂对三七生长、抗病性及相关酶活性的影响，发现诱抗剂的应用可以增加株高、茎粗、叶片大小和干重，并降低植株发病率和病情指数.李盼盼等[13]采用苯并噻二唑(benzothiadiazole,BTH)诱导烟草对青枯病的抗性，表明BTH可显著提高烟草抗性基因的表达.石忠强等[14]采用5种诱抗剂对樱桃流胶病进行了诱抗研究，发现诱抗剂可显著改变植株的相关生理指标.侯珲等[15]研究了BTH和水杨酸(salicylic acid，SA)对甜瓜抗白粉病的诱导作用，发现诱抗剂本身对病原菌无抑制活性，但可显著诱导植株对病菌产生抗性，持效期至少可达17 d.可见，诱抗剂对植物抵抗病害有较好的效果.然而，有关诱抗剂在牡丹植物中的应用还鲜见报道.因此，本研究以凤丹为实验材料，就3种诱抗剂对凤丹抗病害的诱导效果进行实验，以期为牡丹病害的防治提供一种环保、特异性强的新途径.

1 材料与方法

1.1 实验材料与实验地

3种植物病害诱抗剂为康壮素(Harpin)、BTH和SA，由云南省林业科学院重点实验室提供.3种病害菌：红斑病原菌(牡丹枝孢菌Cladosporiumpaeoniae)、灰霉病原菌(牡丹葡萄孢Botrytispaeoniae)和黑斑病原菌(链格孢Alternariaalternata)由自然发生的凤丹病株分离纯化获得.实验地点位于云南省林业科学院树木园牡丹种植基地.

1.2 实验方法

1.2.1 诱抗处理 选取株龄相同、长势一致的凤丹植株，于2016年6月4日(3种病害始发期)分别用不同浓度的3种诱抗剂(Harpin：10、20、30、40、50 mg·L-1；BTH：25、50、75、100、125 mg·L-1；SA：5、10、15、20、25 mg·L-1)喷施凤丹叶面，以清水喷雾作为对照.每个处理随机选取50株，每隔5 d喷施一次，连续喷施12次[14].统计叶片病斑面积和病叶数.每个处理3次重复.

1.2.2 抑菌活性测定 在PDA培养基中分别添加30 mg·L-1Harpin、100 mg·L-1BTH和15 mg·L-1SA，并接种病原菌，在28 ℃下培养3 d，记录菌斑直径.

1.2.3 生理指标测定 用3种诱抗剂(Harpin 30 mg·L-1，BTH 100 mg·L-1，SA 15 mg·L-1)分别连续喷施凤丹叶片3次，每次间隔5 d.然后在样地中随机选取10株，取健康的顶部叶片进行相关指标的分析.色素含量：丙酮提取法；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量：硫代巴比妥酸法；可溶性蛋白含量：考马斯亮蓝G-250染色法；超氧阴离子自由基(superoxide anion free radical,SAFR)含量：羟胺氧化法；过氧化物酶(peroxidase,POD)活性：愈创木酚法；过氧化氢酶(catalase,CAT)活性：紫处吸收法；多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性：比色法；苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)活性：脱氨法[16].

1.3 数据分析

病害严重度分为5级[14].0级：无病斑；1级：病斑面积小于叶面积的1/10；2级：病斑面积大于等于叶面积的1/10且小于1/4；3级：病斑面积大于等于叶面积的1/4且小于1/2；4级：病斑面积大于等于叶面积的1/2且小于3/4；5级：病斑面积大于等于叶面积的3/4.

采用DPS 9.50软件对所得数据进行差异显著性分析(SNK法)。

2 结果与分析

2.1 诱抗剂对凤丹抗主要病害的诱导效果

由表1可知，3种诱抗剂对凤丹抗病害的诱导效果不同，不同浓度的同种诱抗剂的诱抗效果也不同.诱抗效果随着诱抗剂浓度的增高而显著增大，当超过最适浓度时，诱抗效果没有显著变化.其中，Harpin的最适诱抗浓度为30 mg·L-1，BTH的最适诱抗浓度为100 mg·L-1，SA的最适诱抗浓度为15 mg·L-1.这说明3种诱抗剂都可以有效地诱导凤丹对不同病害产生抗性，且凤丹对于诱抗剂的施用量有着较强的敏感性.最适诱抗浓度下，3种诱抗剂对凤丹抗3种病害的诱导效果均表现为红斑病>黑斑病>灰霉病，且以BTH的诱抗效果最佳.其中，BTH对凤丹抗红斑病的诱导效果达47.20%.

表1 不同浓度诱抗剂对凤丹抗主要病害的诱导效果1)Table 1 Induction effect of inducers at different concentrations on P.ostii resistance to main diseases

1)同列数据后附不同大、小写字母者分别表示在0.01、0.05水平上差异显著.

2.2 诱抗剂对凤丹3种病原菌生长的影响

由表2可知，诱抗剂Harpin、BTH和SA对凤丹3种病原菌的萌发生长没有明显的影响，其病斑直径与对照相比均无显著差异.这表明3种诱抗剂在供试浓度条件下对3种凤丹主要病害的病原菌均无抑制活性.

表2 诱抗剂对牡丹主要病害病原菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of inducers on pathogenic fungi of main diseases on P.ostii

2.3 最适浓度诱抗剂对凤丹叶片生理指标的影响

由表3可知，3种诱抗剂均能有效地引起凤丹叶片生理指标的变化.相比对照，显著地提高了可溶性蛋白和色素(叶绿素a、叶绿素b)含量；极显著地增加了相关酶(POD、CAT、PPO和PAL)活性，说明叶片中的相关酶对诱抗剂的反应较为敏感；显著地降低了SAFR和MDA的含量.色素含量和相关酶系活性的增加可能是为了保障较强的光合作用及相关分子结构的稳定，而SAFR和MDA的降低可能是为了清除活性氧物质，有助于提高凤丹对病害的抗性.进一步对诱抗后的感病叶片进行了观察，喷施5次(25 d)后，感病叶片的病斑数不再增多，病斑由边缘向中间逐渐固定、硬化；在连续喷施7次(35 d)时，感病叶片渐渐形成隆起的新愈伤组织，并逐步愈合.

3 讨论

本研究表明，3种诱抗剂对凤丹抗不同病害的诱导效果不同，但都可以有效地诱导凤丹对病害产生抗性，其中以BTH的诱抗效果最佳.BTH是第一个成功商品化的植物病害诱抗剂，能有效诱导多种植物产生SAR[9].但3种诱抗剂对凤丹3种病害的病原菌无抑制活性.这也证明了诱抗剂离体条件下无杀菌活性，但能够诱导植物的免疫活性，起到抗病、防病的作用[17].本研究还发现，凤丹对于诱抗剂的喷施浓度有着较强的敏感性，在一定范围内，随着浓度的升高诱抗效果也升高，但超出一定浓度范围诱抗效果会降低，且叶片表现出早衰、枝条节间缩短等问题.王文娟等[18]的研究也发现了类似的现象，具体原因需进一步研究.

表3 凤丹叶片中相关生理指标的变化1)Table 3 Changes in levels of biochemical indicators in P.ostii leaves

1)*表示与对照相比差异显著，**表示与对照相比差异极显著.

此外，3种诱抗剂的使用提高了凤丹叶片中可溶性蛋白和色素(叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素)含量及相关酶(POD、CAT、PPO和PAL)活性，降低了SAFR和MDA的含量.该结果与左应梅等[12]、石忠强等[14]、侯珲等[15]的研究结果一致.这些指标的变化与植株抗病性密切相关，可能会激活植物的SAR，对此有待进一步研究.

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(责任编辑:杨郁霞)

Effect of induced resistance to diseases ofPaeoniaostiiusing 3 inducers

MIAO Fujun1, AN Manyun2, HUA Mei1, WANG Yi1, YUAN Xiaolong1, CHEN Jian1, WANG Juan1

(1.Key Laboratory for Conservation of Rare, Endangered & Endemic Forest Plants, State Forestry Administration /Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants, Yunnan Academy of Forestry, Kunming, Yunnan 650201, China; 2.Engineering College, Yunnan College of Business Management, Anning, Yunnan 650106, China)

Three inducers (Harpin, BTH and SA) were sprayed toPaeoniaostiiin 5 concentrations, with water spray being the control, total spot area and the number of infected leaves were recorded. Meanwhile, at the optimal concentration of inducers, plaque diameter ofCladosporiumpaeoniae,BotrytispaeoniaeandAlternariaalternatewere compared, key biochemical indicators related to infections were tested. The results showed that all 3 inducers had significant induction effect onP.ostiiresistance to pathogenic fungi, with BTH being the optimal inducer. Averagely induction effect of resistance to fungi in descending order wasC.paeoniae,A.alternata, andB.paeoniae. Superoxide anion free radical and malondialdehyde levels declined dramatically while levels of soluble protein and pigments, and enzymes activity increased compared with the control. In additon, three inducers were not capable of killing pathogens, however, they can stimulate systemic acquired resistance of plant.

Paeoniaostii; inducer; induced-resistance effect; systemic acquired resistance

2016-12-07

2017-03-16

国家林业公益行业科研专项(201204110)；云南省科技计划项目(2015IA005)；云南省森林植物培育与开发利用重点实验室/国家林业局云南珍稀濒特植物保护与繁育重点实验室自主创新项目(ZZCX2016-2)；云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目(2010CI016).

缪福俊(1986-)，男，助理研究员.研究方向：植物学.Email:miaofujun@yeah.net.通讯作者王娟(1966-)，女，教授，博士.研究方向：植物学.Email:schima@163.com.

Q945.8

A

1671-5470(2017)03-0250-04

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.03.003