微生物发酵床大栏养猪垫料中曲霉菌的分离与鉴定

肖荣凤, 朱育菁, 刘 波, 潘志针, 刘国红, 刘 芸

(福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建 福州 350003)

微生物发酵床大栏养猪垫料中曲霉菌的分离与鉴定

肖荣凤, 朱育菁, 刘 波, 潘志针, 刘国红, 刘 芸

(福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建 福州 350003)

从福建省福清和永泰2个基地共采集106份垫料样品，采用稀释平板法分离曲霉菌.对从不同样品中分离到的曲霉菌菌株的初步形态进行归类后，从不同类群中共选取10个代表性菌株，经菌落培养和菌体形态观察，再结合β-微管蛋白基因(BenA)序列分析进行种类鉴定.共鉴定出曲霉菌6个种，即构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、亮白曲霉(A.candidus)、聚多曲霉(A.sydowii)、土曲霉(A.terreus)、黄曲霉(A.flavus)和烟曲霉(A.fumigatus).从福清养猪发酵床垫料中分离鉴定出除烟曲霉外的其他5种曲霉菌，而从永泰养猪发酵床中仅分离到土曲霉、黄曲霉和烟曲霉.结果表明养猪地区不同，其发酵床中的曲霉菌种类组成存在差异.

垫料; 曲霉菌; 鉴定; 形态学; 分子系统学

微生物发酵床大栏养猪是近年来发展起来的一种环保养殖模式，其原理是利用农业废弃物如谷壳、秸秆、锯糠和椰糠等制作成发酵床垫料，然后接种芽胞杆菌(Bacillusspp.)，从而为养猪提供垫料层，方便猪尿和粪便被垫料吸收并被微生物分解，达到除臭和除异味的目的[1].但是，通常情况下，发酵床垫料使用1～2 a后，其中所含营养组分为各种微生物的生长和繁殖提供了有利条件.除本身带有各种微生物之外，垫料和猪粪还可为养殖环境周围空气中的微生物提供生长和繁殖栖境.目前，有关养猪发酵床垫料中的青霉菌已有报道[2]，未见有关曲霉菌的相关报道.

曲霉属(Aspergillus)是自然界分布最普遍的真菌之一，已报道有180多个种和变种，分属于7个亚属[3].许多曲霉菌因可产生多种有机酸、酶类及多种有用的次生代谢物，可用于酿造业、发酵工业及生物工程[4-6].在农业生产中，部分曲霉菌可作为发酵菌剂参与农副产物的发酵，如黑曲霉菌A.niger已广泛应用于生产有机肥料[7].另外，部分曲霉菌可引起谷物、食品、饲料以及工业材料和制品的霉腐变质[8]，或者产生多种真菌毒素而影响食品安全[9-10].少数曲霉菌是人和动物的致病菌[11].

曲霉属的鉴定与分类较为复杂，传统方法是使用查氏琼脂培养基(CA)、查氏酵母琼脂培养基(CYA)和麦芽浸膏琼脂(MEA)作为鉴定和描述的标准培养基，并结合显微镜下产孢结构形态特征进行鉴定.这往往需要较好的分类与鉴定经验，否则容易出现错误的鉴定结果.近年来，利用β-微管蛋白基因(beta-tubulin gene,BenA)序列分析的方法辅助曲霉菌鉴定，从而提高了曲霉菌鉴定的准确率和效率[12].

本研究将形态特征观察和BenA基因序列分析相结合，对曲霉菌进行了分类鉴定，以期为养猪环境的监测和科学利用微生物发酵床提供理论指导.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品 于2015年2-8月份在福建现代微生物发酵床大栏养猪福清基地和永泰基地采集样品，共计106份.发酵床垫料成分主要为谷壳、秸秆、锯糠和椰糠等，已发酵1 a.

1.1.2 培养基 包含300 μg·mL-1硫酸链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、查氏琼脂培养基(CA)和查氏酵母培养基(CYA).配制方法参见文献[13].

1.1.3 试剂 真菌基因组DNA提取试剂盒的型号为Bioteke DP2032，PCR反应所需试剂均购自铂尚生物技术(上海)有限公司.本文除特殊注明的试剂外，其他试剂均为国产分析纯试剂.苯胺蓝染色液包括10 g苯酚结晶品、20 mL乳酸、40 mL甘油、0.05 g水溶性苯胺蓝、20 mL蒸馏水，将苯酚、乳酸和甘油溶解于蒸馏水中，再加入水溶性苯胺蓝，摇匀，备用.

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离与纯化 称取垫料样品10 g于含90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，配成稀释10倍的悬浮液，再依次梯度稀释成100、1 000和10 000倍的悬浮液.吸取100 μL菌悬液滴加到含300 μg·mL-1硫酸链霉素的PDA平板中央，然后均匀涂布，每个梯度重复3次，置于28 ℃培养；3～7 d后选取不同的单菌落，挑取菌落边缘的菌丝接种于PDA培养基上进行纯化培养.将从不同样品中分离纯化培养的菌株，根据菌落形态和色泽进行初步归类，选择不同类型菌落的代表性菌株1～2株进行标准化培养和鉴定.

1.2.2 菌株的形态学鉴定 参照孔华忠等[13]和Nyongesa et al[14]的方法进行培养和鉴定.对于纯化后的菌株，用接种环蘸取孢子，分别点接于CA和CYA平板上，于28 ℃静置培养3～7 d，然后观察菌落形状、质地和颜色等特征，每处理点接3个平板.另取一接种后的平板，待菌丝刚长出时，将无菌的盖玻片斜插入平板内，继续培养至孢子成熟，取出盖玻片，用酒精灯火焰进行固定；滴上适量的苯胺蓝染色液，染色1～2 h后于水中轻柔漂洗后晾干，放在载玻片上，于倒置显微镜下观察孢子的着生状部及分生孢子梗的形态特征等.

1.2.3 菌株的分子鉴定 从培养7～10 d的平板上刮取约50 mg菌丝于样品研磨仪(型号MP*FastPrep-24)，采用真菌基因组DNA试剂盒提取各菌株的基因组DNA.往含菌丝体的收集管中加入预热缓冲液FP1后，用样品研磨仪研磨40 s，重复1次，具体步骤参照试剂盒说明书.采用引物Bt2a/Bt2b:GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC/ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC进行BenA基因扩增[15].PCR反应体系25 μL：BenA基因引物各1 μL，2×PowerTaqPCR MasterMix (Bioteke) 12.5 μL，无菌双蒸水9.5 μL，DNA 1 μL；以无菌双蒸水作为阴性对照.PCR扩增程序[12]：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环.72 ℃延伸6 min.PCR产物经1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测后，送交铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序.将测得的序列提交GenBank注册获得登录号，进行BLAST搜索和同源性比对分析.选择同源性高于99%的种，进一步通过ARS Culture Collection (NRRL)网站查找相应的模式菌株编号；将获得的NRRL编号输入NCBI网站检索，并下载BenA基因序列，用Clustal W软件进行比对.系统发育树分析采用软件MEGA 5中的N-J法，检验各分支的置信度.

2 结果与分析

2.1 曲霉属菌株的形态学鉴定

从不同垫料样品中共分离纯化出226个疑似曲霉菌的分离物，根据其在PDA平板上的菌落形态和色泽将其初步归为6类；进一步根据分离地点的不同，挑选有代表性菌株1～2株进行标准化培养和鉴定.

2.1.1 构巢曲霉Aspergillusnidulans菌株编号为FJAT-30987，分离自福清基地.在CYA培养基上28 ℃培养7 d.菌落平均直径48 mm，质地绒状，浅绿色至草绿色；中心有脐状突起，平坦或有少量放射状皱纹(图1A)；菌落背面显黄褐色有放射状皱纹(图1B).在CA 培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径30 mm，质地绒状，灰白色至浅黄色；中心有脐状突起(图1C)，菌落背面浅黄色(图1D).在显微镜下，菌株分生孢子头呈放射形，分生孢梗茎壁平滑，顶囊半球形，产孢结构双层，分生孢子球形，灰绿色，3.0～4.5 μm(图1E、1F).

A、B.CYA培养基上菌落形态(正面和背面)；C、D.CA培养基上菌落形态(正面和背面)；E、F.显微镜下不同菌体形态(标尺：20 μm).图1 菌株FJAT-30987的形态特征Fig.1 The morphological characteristics of strain FJAT-30987

2.1.2 亮白曲霉Aspergilluscandidus菌株编号为FJAT-30990，分离自福清基地.它生长缓慢，在CYA培养基上28 ℃培养7 d；菌落平均直径6 mm，质地绒状，白色，中部稍隆起(图2A)；菌落背面呈淡黄色至白色(图2B).在CA培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径16 mm，质地绒状，灰白色至白色，中部稍隆起(图2C)，菌落背面浅黄色至白色(图2D).在显微镜下，菌株分生孢子头疏松且不规则叉开，或呈近球形，分生孢梗茎壁平滑，顶囊呈半球形，产孢结构双层，分生孢子呈球形，无色，1.8～2.5 μm(图2E、2F).

A、B.CYA培养基上菌落形态(正面和背面)；C、D.CA培养基上菌落形态(正面和背面)；E、F.显微镜下不同菌体的形态(标尺：20 μm).图2 菌株FJAT-30990的形态特征Fig.2 The morphological characteristics of strain FJAT-30990

2.1.3 聚多曲霉Aspergillussydowii菌株编号为FJAT-30991和FJAT-30993，分离自福清基地.生长较缓慢，在CYA培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径19 mm，质地绒状，灰绿色，中部稍隆起，有少量放射状皱纹(图3A)，菌落背面呈深褐色或红褐色(图3B).在CA培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径16 mm，质地绒状，扁平，呈土黄色或灰白色(图3C)，菌落背面呈浅黄色(图3D).在显微镜下，菌株分生孢子头呈球形或辐射形，分生孢梗茎壁平滑，顶囊呈半球形，产孢结构双层，分生孢子呈球形，浅绿色，2.5～3.5 μm(图3E、3F).

A、B.CYA培养基上菌落形态(正面和背面)；C、D.CA培养基上菌落形态(正面和背面)；E、F.显微镜下不同菌体的形态(标尺：20 μm).图3 菌株FJAT-30991和FJAT-30993的形态特征Fig.3 The morphological characteristics of strains FJAT-30991and FJAT-30993

2.1.4 土曲霉Aspergillusterreus菌株编号为FJAT-31011和FJAT-31038，分离自福清基地和永泰基地.在CYA培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径38 mm，质地绒状，土褐色(图4A)，菌落背面黄褐色(图4B).在CA培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径20 mm，质地绒状，灰白色至白色，边缘呈射状(图4C)，菌落背面呈黄褐色(图4D).在显微镜下，菌株分生孢子头呈放射形，分生孢梗茎壁平滑，顶囊呈半球形，分子孢子头到后期形成致密的直柱形，产孢结构双层，分生孢子球形或近球形，1.8～2.5 μm(图4E、4F).

A、B.CYA培养基上菌落形态(正面和背面)；C、D.CA培养基上菌落形态(正面和背面)；E、F.显微镜下不菌体的形态(标尺：20 μm).图4 菌株FJAT-31011和FJAT-31038的形态特征Fig.4 The morphological characteristics of strain FJAT-31011 and FJAT-31038

2.1.5 黄曲霉Aspergillusflavus菌株编号为FJAT-30998和FJAT-31042，分离自福清基地和永泰基地.在CYA培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径45 mm，质地绒状，黄绿色至草绿色，边缘白色.丝绒状, 中央凸起, 有放射状沟纹(图5A)，菌落背面灰白色，可产生菌核(图5B).在CA培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径48 mm，质地绒状，中间部分呈黄色，边缘呈黄色或白色(图5C)，菌落背面呈淡褐色或灰白色(图5D).在显微镜下，菌株分生孢子头呈放射形，分生孢梗茎壁平滑，顶囊呈半球形，产孢结构双层，分生孢子呈黄色，球形或近球形，4.0～5.5 μm(图5E、5F).

A、B.CYA培养基上菌落形态(正面和背面)；C、D.CA培养基上菌落形态(正面和背面)；E、F.显微镜下不同菌体的形态(标尺：20 μm).图5 菌株FJAT-30998和FJAT-31042的形态特征Fig.5 The morphological characteristics of strains FJAT-30998 and FJAT-31042

2.1.6 烟曲霉Aspergillusfumigatus菌株编号为FJAT-31045和FJAT-31052，分离自永泰基地.在CYA培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径45 mm，质地呈绒状，暗绿色边缘呈白色，丝绒状或絮状(图6A)，菌落背面呈淡黄色(图6B).在CA培养基上28 ℃培养7 d，菌落平均直径48 mm，质地绒状，较稀疏，灰白色(图6C)，菌落背面淡褐色(图6D).在显微镜下，菌株分生孢子头放射形，分生孢梗茎壁平滑，顶囊半球形或棒形，产孢结构单层，分生孢子无色，呈球形或近球形，2.5～3.0 μm(图6E、6F).

A、B.CYA培养基上菌落形态(正面和背面)；C、D.CA培养基上菌落形态(正面和背面)；E、F.显微镜下不同菌体的形态(标尺：20 μm).图6 菌株FJAT-31045和FJAT-31052的形态特征Fig.6 The morphological characteristics of strains FJAT-31045 and FJAT-31052

2.2 菌株的分子鉴定

利用供试菌株和从ARS Culture Collection (NRRL)网站下载的编号为NRRL的模式菌株的BenA基因序列共同构建系统发育树，结果表明(图7)，菌株FJAT-31011和FJAT-31038与土曲霉A.terreus菌株NRRL255、菌株FJAT-30988，FJAT-31042与黄曲霉A.flavus菌株NRRL1957，菌株FJAT-30990与亮白曲霉A.candidus菌株NRRL303，菌株FJAT-30987与构巢曲霉A.nidulans菌株NRRL187，菌株FJAT-30991和FJAT-30993与聚多曲霉A.sydowii菌株NRR250，菌株FJAT-31045和FJAT-31052与烟曲霉A.fumigatus菌株NRRL163，均以99%以上的置信度聚在1支上.菌株的GenBank序列登录号分别为KU737552(FJAT-30987)、KU737553(FJAT-30990)、KU737554(FJAT-30991)、KU737555(FJAT-30993)、KU737556(FJAT-30988)、KU737557(FJAT-31042)、KU737558(FJAT-31011)、KU737559(FJAT-31038)、KU737560(FJAT-31045)和KU737561(FJAT-31052).

图7 基于beta-tubulin (BenA)基因序列构建的分子系统发育树Fig.7 Neighbor-joining trees of beta-tubulin gene sequences of the strains

3 小结

本研究从福建现代微生物发酵床大栏养猪福清基地和永泰基地采集的106份垫料样品中，共分离到6种曲霉菌.通过BenA基因序列构建的分子系统发育树，进一步验证了形态鉴定结果，确认这6种曲霉菌为构巢曲霉A.nidulans、亮白曲霉A.candidus、聚多曲霉A.sydowii、土曲霉A.terreus、黄曲霉A.flavus和烟曲霉A.fumigatus.从福清基地分离到除烟曲霉外的5种菌，从永泰基地仅分离到土曲霉、黄曲霉和烟曲霉.养猪地区不同，其发酵床中曲霉菌种类组成存在差异.

[1] 刘波,郑雪芳,朱昌雄,等.脂肪酸生物标记法研究零排放猪舍基质垫层微生物群落多样性[J].生态学报,2008,28(11):5 488-5 498.

[2] 肖荣凤,王阶平,刘波,等.大栏养猪微生物发酵床垫料中青霉菌的分离与鉴定[J].福建农业学报,2016,31(2):189-193.

[3] PITT J I, SAMSON R A. Integration of Modern Taxonomic Methods forPenicilliumandandAspergillusClassification[M]. UK：Hardwood Academic Publishers, 2000:51-72.

[4] LU F, PING K K, WEN L, et al. Enhancing gluconic acid production by controlling the morphology ofAspergillusnigerin submerged fermentation[J]. Process Biochemistry, 2015,50:1 342-1 348.

[5] CYNDY M F, ODACY C D S, MINELLI A S, et al. High-level lipase production byAspergilluscandidusURM 5611 under solid state fermentation (SSF) using waste fromSiagruscoronata(Martius)Becari[J]. African Journal of Biotechnology, 2015,14(9):820-828.

[6] SYED M B, RAJASIMMAN M. Fermentative production and optimization of mevastatin in submerged fermentation usingAspergillusterreus[J]. Biotechnology Reports, 2015,108:124-128.

[7] MENDES G D E O, DASILVA N M, ANASTACIO T C, et al. Optimization ofAspergillusnigerrock phosphate solubilization in solid-state fermentation and use of the resulting product as a P fertilizer[J]. Microbial Biotechnology, 2015,8(6):930-939.

[8] YAZDANI D, ZAINAL ABIDIN M A, TAN Y H, et al. Molecular identification ofAspergillusandEurotiumspecies isolated from rice and their toxin-producing ability[J]. Microbiology, 2011,80(5):720-727.

[9] PITT J I, HOCKING A D.Aspergillusand Related Teleomorphs[M]. London: Fungi and Food Spoilage, 2009:275-337.

[10] HUBKA V, KOLARIK M, KUBATOVA A, et al. Taxonomic revision ofEurotiumand transfer of species toAspergillus[J]. Mycologia, 2013,105(4):912-937.

[11] BANDH S A, KAMILI A N, GANAI B A. Identification of someAspergillusspecies isolated from Dal Lake, Kashmir by traditional approach of morphological observation and culture[J]. African Journal of Microbiology Research, 2012,6(29):5 824-5 827.

[12] NASRI T, HEDAYATI M T, ABASTABAR M, et al. PCRk-RFLP on β-tubulin gene for rapid identification of themost clinically important species ofAspergillus[J]. Journal of Microbiological Methods, 2015,117:144-147.

[13] 孔华忠,王龙.中国真菌志(第35真卷):青霉属及其相关有性型属[M].北京:科学出版社,2007:1-284.

[14] NYONGESA B W, OKOTH S, AYUGI V. Identification key forAspergillusspecies isolated from maize and soil ofNandicounty, Kenya[J]. Advances in Microbiology, 2015,5:205-229.

[15] GLASS N L, DONALDSON G C. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995,61(4):1 323-1 330.

(责任编辑:叶济蓉)

Isolation and identification ofAspergillusfrom microbial fermentation beds for pig raising

XIAO Rongfeng, ZHU Yujing, LIU Bo, PANG Zhizhen, LIU Guohong, LIU Yun

(Agricultural Bio-resources Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350003, China)

In order to guarantee swine health and screen potentially usefulAspergillusspecies from microbial fermentation bedding system for pig breeding, 106 litter samples were collected from the microbial fermentation beds in 2 bases in Yuxi and Yongtai, Fuzhou, for distribution analysis. Firstly,Aspergillusspecies were isolated and 10 typical strains ofAspergilluswere identified based on colony and microscopic morphology, together with phylogenetic analysis of beta-tubulin gene (BenA). The results showed that 6 out of 10 isolates were identified asAspergillus, includingA.nidulans,A.candidus,A.sydowii,A.terreus,A.flavusandA.fumigatus. Among them, 5 species exceptA.fumigatuswere detected in beddings from Yuxi while onlyA.terreus,A.flavusandA.fumigatuswere found in beddings from Yongtai.

litter；Aspergillus； identification； morphology； molecular phylogeny

2016-08-04

2016-11-22

国家农业成果转化(闽财指2014-969号);福建省属公益类项目(2015R1018-3);福建省重大专项资助项目(2015NZ0003-1).

肖荣凤(1977-)，女，副研究员.研究方向：农业微生物及其应用.Email：xrfxiao@163.com.通讯作者刘波(1957-)，男，研究员.研究方向：农业微生物.Email: fzliubo@163.com.

S182

A

1671-5470(2017)03-0336-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.03.017