姬松茸不同提取物对UVB致HaCaT细胞光损伤的保护作用研究

朱燕 黄真 钟晓明

浙江中医药大学药学院杭州310053

姬松茸不同提取物对UVB致HaCaT细胞光损伤的保护作用研究

朱燕 黄真 钟晓明

浙江中医药大学药学院杭州310053

[目的]研究姬松茸不同提取物对中波紫外线（ultraviolet B，UVB）致人永生化角质形成细胞（HaCaT）光损伤的保护作用。[方法]采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法测定不同剂量UVB对正常HaCaT细胞存活率的影响，姬松茸不同提取物对正常HaCaT细胞存活率的影响，以及姬松茸不同提取物对UVB所致光损伤的HaCaT细胞存活率的影响。[结果]①不同剂量UVB照射后细胞存活率均下降，且呈剂量依赖性，当UVB达20mj/cm2时，细胞存活率为53.23%。②姬松茸水提物浓度在0.2～4mg·mL-1、醇提物在0.1～2mg·mL-1、粗多糖在0.2～1mg·mL-1时具有促进HaCaT细胞增殖的作用，醇提物和粗多糖浓度增大则抑制细胞生长。③姬松茸水提物浓度在1～4mg·mL-1、醇提物在1～2mg·mL-1、粗多糖在0.5～1mg·mL-1均能显著提高20mj/cm2UVB照射后HaCaT细胞的存活率（P＜0.01）。[结论]姬松茸不同提取物可以在一定程度上减轻UVB诱导的HaCaT细胞的光损伤，具有抗皮肤光老化的潜力。

姬松茸；水提物；醇提物；粗多糖；HaCaT；UVB；保护作用

近年来，随着环境污染的日益严重，到达地球表面的紫外线（ultraviolet，UV）日益增多，长期或过量的紫外线辐射可导致皮肤损伤或癌变[1-2]，紫外线辐射对健康的危害已成为全球关注的重大环境与健康问题之一。有关紫外线辐射的机制和防治是目前研究的热点之一。姬松茸（Agaricus blazei Murrill）又名巴西蘑菇，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属，是一种珍稀的食药兼用真菌[3]。姬松茸子实体富含多糖、蛋白质、脂肪酸、凝集素、甾醇、维生素和微量元素等多种化学成分。研究表明姬松茸具有较强的清除自由基、超氧阴离子等的体外抗氧化能力[4-6]，还具有抗辐射、抗炎、抗肿瘤、提高机体免疫力等多种生物活性[7-8]。但目前为止尚无有关姬松茸抗UV损伤方面的研究报道，因此本实验选择人永生化角质形成细胞（HaCaT）作为受试细胞，在体外建立中波紫外线（ultraviolet B，UVB）照射致HaCaT细胞光损伤模型，研究姬松茸不同提取物对UVB致HaCaT细胞光损伤的保护作用。

1 材料

1.1 药材姬松茸，网上购得，产于云南丽江，经浙江中医药大学药学院中药资源研究所陈孔荣副教授鉴定为蘑菇科蘑菇属姬松茸（Agaricus blazei Murrill）。

1.2 细胞株HaCaT细胞购于中国典型培养物保藏中心CCTCC（武汉）。

1.3 主要试剂和仪器MEM培养液（吉诺生物医药技术有限公司，15122907），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，20151228），0.25%胰酶-EDTA（南京凯基生物技术发展有限公司，20151111），DMSO、MTT（美国sigma，37900160、0732C226）。CO2培养箱（Thermo公司），SS-01B紫外线光疗仪（上海SIGMA高技术有限公司），倒置光学显微镜（日本Nikon公司），酶标仪（美国BIO-TEK）。

2 方法

2.1 姬松茸不同提取物的制备姬松茸水提物制备[9]：取姬松茸粉末10g，按1:20加蒸馏水，在85℃提取2次，每次2.5h，过滤合并滤液，回收溶剂，真空干燥，备用。姬松茸醇提物制备[10]：取姬松茸粉末10g，按1: 25加80%乙醇，在60℃提取3次，每次2h，过滤合并滤液，回收溶剂，真空干燥，备用。姬松茸粗多糖制备[9]：取姬松茸粉末10g，按1:20加蒸馏水，在85℃提取2次，每次2.5h，过滤合并滤液，浓缩至一半体积，加乙醇至体积分数为75%，置于4℃静置过夜，离心，取沉淀真空干燥，备用。

2.2 HaCaT细胞的培养及接种HaCaT细胞用含10%胎牛血清的MEM培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。当细胞融合达80%左右时，加入0.25%胰酶-EDTA消化液消化传代，以4×104个/ mL的细胞密度接种于96孔板中，置于培养箱中培养。

2.3 MTT法测定细胞存活率根据文献[11]方法于510nm波长处测定各孔吸光度（OD值），每组取6个复孔的平均值计算细胞存活率。细胞存活率=（OD处理组-OD空白组）/（OD正常组-OD空白组）×100%。

2.4 不同剂量UVB照射对HaCaT细胞存活率的影响将细胞分为空白对照组、正常对照组和UVB各剂量组，每组6个复孔。培养24h后，空白对照组和正常对照组用锡箔纸覆盖，UVB各剂量组分别用0、10、20、30、40、50、60、70、80mj/cm2的UVB照射，继续培养24h后用倒置显微镜观察细胞形态，并用MTT法检测细胞存活率。实验重复3次。

2.5 姬松茸不同提取物对HaCaT细胞存活率的影响将细胞分为空白对照组、正常对照组和各剂量给药组，每组6个复孔。培养24h后，各剂量给药组按提取物浸膏量分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4mg·mL-1的含药培养液，空白对照组和正常对照组加入MEM培养液，继续培养24h后，用MTT法检测细胞的存活率。实验重复3次。

2.6 姬松茸不同提取物对UVB照射HaCaT细胞存活率的影响将细胞分为空白对照组、正常对照组、模型组和各剂量给药组，每组6个复孔。培养24h后，各剂量给药组分别加入相应剂量的含药培养液，其他各组加MEM培养液，继续培养24h后，空白对照组和正常对照组用锡箔纸覆盖，模型组和各剂量给药组给予20mj/cm2的UVB照射，然后继续培养24h，用MTT法检测细胞存活率。实验重复3次。

2.7 统计学方法采用SPSS13.0软件进行分析，实验结果以均数±标准差（±s）表示，各组间细胞存活率采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 姬松茸各提取物得率将姬松茸按照2.1项下的方法提取干燥后，得提取物提取得率，见表1。

表1 姬松茸各提取物的得率Tab.1 Extract yield of Agaricus blazei Murrill

3.2 不同剂量UVB照射对HaCaT细胞存活率的影响倒置显微镜下观察可见，正常对照组细胞形态一致，排列紧密，边界清楚，呈典型的铺路石样。UVB各剂量组细胞均表现为不同程度的损伤，细胞数减少，细胞变圆，间隙变大，形态模糊，出现漂浮、碎片（图1）。不同剂量UVB照射后细胞存活率明显下降（P＜ 0.01），且其下降程度与UVB照射剂量呈正相关（表2）。当UVB剂量达20mj/cm2时，对HaCaT细胞的抑制率达46.77%，UVB的半数抑制剂量为19.40mj/ cm2，95%置信区间为（16.97，21.69），故选择20mj/cm2作为造模剂量。

图1 不同剂量UVB照射后的HaCaT细胞形态（×10）Fig.1 Morphology of HaCaT cells irradiated by different dose of UVB（×10）

表2 不同剂量UVB照射对HaCaT细胞存活率的影响（±s，n=3）Tab.2 The cell viability of HaCaT cells irradiated by different dose of UVB（±s，n=3）

表2 不同剂量UVB照射对HaCaT细胞存活率的影响（±s，n=3）Tab.2 The cell viability of HaCaT cells irradiated by different dose of UVB（±s，n=3）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01。Note:Compared with normal control group,**P＜0.01.

UVB造模剂量（mj/cm2）细胞存活率（%）0 10 20 30 40 50 60 70 80 100.00±0.00 77.42±3.66**53.23±2.99**25.75±0.88**18.73±3.65**14.46±1.52**10.73±3.67**8.79±3.26**8.32±3.47**

3.3 姬松茸不同提取物对HaCaT细胞存活率的影响由表3可知，与正常对照组相比，姬松茸水提物在0.2～4mg·mL-1浓度时HaCaT细胞存活率明显提高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；姬松茸醇提物在0.1～2mg·mL-1浓度时HaCaT细胞存活率明显提高，剂量增大则细胞存活率下降，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；姬松茸粗多糖在0.2～1mg·mL-1浓度量时HaCaT细胞存活率明显提高，剂量增大则对细胞存活率下降，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果显示水提物在0.1～4mg·mL-1、醇提物在0.1～ 2mg·mL-1、粗多糖在0.1～1mg·mL-1浓度时无细胞毒性，因此各自选择以上浓度作为后续实验的安全给药浓度。

表3 姬松茸不同提取物对HaCaT细胞存活率的影响（±s，n=3）Tab.3 The cell viability of HaCaT cells treated by different extraction of Agaricus blazei Murrill（±s，n=3）

表3 姬松茸不同提取物对HaCaT细胞存活率的影响（±s，n=3）Tab.3 The cell viability of HaCaT cells treated by different extraction of Agaricus blazei Murrill（±s，n=3）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with normal control group,*P＜0.05,**P＜0.01.

浓度（mg·mL-1）水提物（%）醇提物（%）粗多糖（%）0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 2 3 4 100.00±0.00 103.07±1.25 103.91±1.05*104.66±0.67*105.84±0.92**107.06±1.38**108.26±2.10**109.22±1.72**109.97±1.82**110.84±2.86**111.94±2.26**113.21±3.36**112.74±1.91**109.52±3.72**100.00±0.00 103.65±1.11*105.71±1.45**107.36±1.23**108.64±1.40**109.05±1.36**111.37±1.14**111.92±1.01**112.64±0.59**114.35±0.61**115.79±1.20**119.39±0.90**61.47±3.33**3.35±0.65**100.00±0.00 102.36±0.50 103.66±0.76*105.01±1.91**106.36±1.77**108.42±1.96**109.64±1.84**110.35±1.67**110.84±1.44**111.44±1.64**113.57±2.27**71.30±3.32**9.56±0.99**6.93±2.61**

3.4 姬松茸不同提取物对UVB照射HaCaT细胞存活率的影响由表4可知，与正常对照组相比，模型组细胞存活率显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，各剂量给药组细胞存活率均增加。姬松茸水提物随着给药剂量的增加，HaCaT细胞的存活率呈先上升后下降的趋势，且在1～4mg·mL-1浓度时差异显著，有统计学意义（P＜0.01）；姬松茸醇提物随着给药剂量的增加，HaCaT细胞的存活率呈先上升后下降的趋势，且在1～2mg·mL-1浓度时差异显著，有统计学意义（P＜0.01）；姬松茸粗多糖随着给药剂量的增加，HaCaT细胞的存活率逐渐增加，且在0.5～1mg·mL-1浓度时差异显著，有统计学意义（P＜0.01）。

4 讨论

日光中的紫外线是导致皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素[12]。紫外线根据波段可分为长波紫外线（ultraviolet A，UVA）、UVB和短波紫外线（ultraviolet C，UVC），UVC可以被大气臭氧层吸收和散射，因此UVC不能到达地球表面。能照射到地球上的阳光紫外线是UVA和UVB，分别占总量的95%和5%[12]。UVB的生物学效应强度是UVA的800～1000倍[2]，可直接作用于DNA或诱发氧化反应产生自由基等机制作用于机体细胞，导致皮肤中自由基浓度增高，是导致皮肤光老化的最主要因素[13]。所以本实验选择UVB为造模光源。

UVB主要作用于表皮，角质形成细胞占表皮细胞的90%以上，角质形成细胞是UVB作用的靶细胞[14]。HaCaT细胞是人永生化角质形成细胞，在形态学和生物学特性上与正常人角质形成细胞相似，保持有正常人角质形成细胞的分化和增殖的特性，无肿瘤原性[15]，且培养条件相对简单，易于增殖，能大规模培养。因此，本实验选用HaCaT细胞株作为研究对象。

表4 姬松茸不同提取物对UVB造模HaCaT细胞存活率的影响（±s，n=3）Tab.4 The cell viability of HaCaT cells irradiated by UVB after treatment with different extraction of Agaricus blazei Murrill（±s，n=3）

表4 姬松茸不同提取物对UVB造模HaCaT细胞存活率的影响（±s，n=3）Tab.4 The cell viability of HaCaT cells irradiated by UVB after treatment with different extraction of Agaricus blazei Murrill（±s，n=3）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组相比，##P＜0.01。Note:Compared with normal control group,**P＜0.01;compared with model group,##P＜0.01.

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由实验结果可知，不同剂量UVB照射后细胞存活率均下降，且呈剂量依赖性，当UVB达20mj/cm2时，细胞存活率为53.23%，较正常对照组有显著差异（P＜0.01），接近半数抑制，且与UVB达到地球表面的辐射强度相当，为18～30mj/cm2[16]，若再增大造模剂量，细胞损伤过度，可能出现不可逆转的凋亡，不利于观察一些药物的保护作用，故选择20mj/cm2作为造模剂量。本实验在进行UVB造模时，在两组细胞之间增加一列PBS，将两组细胞隔开，避免细胞在造模时互相受到影响。

本实验发现姬松茸水提物、醇提物及粗多糖在适宜浓度时均可抑制UVB诱导的细胞光损伤并提高其细胞存活率。姬松茸水提物在1～4mg·mL-1、醇提物在1～2mg·mL-1、粗多糖在0.5～1mg·mL-1具有一定的光保护作用。相比而言，低浓度（≤1mg·mL-1）时粗多糖的保护作用较好，较高浓度（＞1mg·mL-1）则水提物的作用较强，且当水提物剂量为3mg·mL-1时，保护作用最佳。姬松茸提取物能够保护HaCaT细胞而减少UVB引起的损伤，在一定范围可促进角质形成细胞增殖，其机制可能与姬松茸提取物抑制UVB辐射引起的细胞氧化损伤，增强其抗氧化能力有关。因本实验结果还仅是处于细胞水平的体外初步研究，因此具体的抗光损伤的分子机制和体内保护效果还有待进一步深入研究。综合上述实验结果为姬松茸提取物对UVB诱导的HaCaT细胞的光损伤的保护作用提供了一定的理论依据，为姬松茸的进一步开发和利用奠定基础，同时为进一步研究其保护作用的机制提供理论基础。

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《浙江中医药大学学报》编辑部

2017年5月18日

Protective Effect of Different Extraction of Agaricus blazei Murrill on HaCaT Cells Damaged by UVB

ZHU Yan,HUANG Zhen,ZHONG Xiaoming College of Pharmacy Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To investigate the protective effects of different extraction of Agaricus blazei Murrill on HaCaT cells damaged by UVB.[Methods]The cell viability which was detected by MTT method was used to determine the impact of different dose of UVB and different extraction of Agaricus blazei Murrill on normal HaCaT cells and HaCaT cells damaged by UVB.[Results]①The HaCaT cells viability declined after irradiation with UVB,and it was a dose-dependent manner.The cell viability was 53.23%when the dose of UVB was 20mj/cm2.②The water extraction at the concentration of 0.2～4mg·mL-1, aqueous extraction at the concentration of 0.1～2mg·mL-1and crude polysaccharide at the concentration of 0.2～1mg·mL-1could promote the proliferation of HaCaT cells,while aqueous extraction and crude polysaccharide inhibited the proliferation of HaCaT cells at higher concentrations.③The water extraction at the concentration of 1～4mg·mL-1,aqueous extraction at the concentration of 1～2mg·mL-1and crude polysaccharide at the concentration of 0.5～1mg·mL-1could enhance the cells viability which was irradiated by 20mj/cm2UVB（P＜0.01）.[Conclusion]The different extraction of A garicus blazei Murrill all could relieve the photo-damage caused by UVB,and it has the potential of anti-photoaging.

Agaricus blazei Murrill；water extraction；aqueous extraction；crude polysaccharide；HaCaT；UVB；protective effect

R282.71

A

1005-5509（2017）06-0458-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.06.003

2017-01-06）

浙江省新苗人才计划项目（2015R410007）

Fund project:New-shoot Talents Program of Zhejiang Province(2015R410007)

钟晓明，E-mail：k6_zxm@sina.com