湖北海棠水提物减轻乌头对心脏毒性的研究

刘兰庆汪鋆植,2邓改改,2李平媛,2边宇,2聂淞莹,2柳杰,2程凡,2

(1.三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室,湖北 宜昌443002；2.湖北省生物酵素工程技术研究中心,湖北宜昌443002)

湖北海棠[Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.]为蔷薇科苹果属植物,其嫩叶作为茶叶饮用已有千年历史.卫生部2014年第20号公告批准湖北海棠(茶海棠)叶为新食品原料.同时,湖北海棠也是土家族常用药,收载于《湖北省中药材质量标准》[1].研究表明湖北海棠具有抗氧化、保肝、降血糖、抗病毒等多种药理作用[1-2],有良好的研究利用价值.有学者认为土家族“药王昏死茶露醒”传说中的茶露即为湖北海棠叶上的露水[3-4].该传说明确指出茶露能解“乌头”之毒,有研究表明,富含黄酮类化合物的中药具有减轻乌头毒性的作用[5].湖北海棠富含黄酮类化合物,对酒精、CCl4等肝损伤有保护作用[6-7].因此,本文探讨湖北海棠对乌头毒性的影响,为合理利用湖北海棠提供依据.

1 材料与仪器

1.1 实验材料

湖北海棠叶,乌头块根均采于湖北省长阳土家族自治县,经三峡大学生物与制药学院王玉兵博士鉴定原植物为湖北海棠[Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.]、乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)；乌头碱对照品购自北京恒元启天化工技术研究院(批号MUST-11031101,HPLC 鉴定其纯度≥99%)；LDH检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所(批号20191015)；硫酸阿托品注射液为天津药业集团新郑股份有限公司生产(国药准字H41021256)；乙腈、甲醇为色谱级,纯水为去离子重蒸水,其他试剂均为分析纯.

1.2 主要仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪(日本岛津)；色谱柱UItimate XB-C18(5μm,4.5 mm×250 mm)；L-530型台式低速离心机(湖南湘仪公司)；CP225D 型电子天平(Sartorius公司)；SW-CJ-2ED 超净工作台(天津市泰斯特仪器有限公司)；CO2培养箱(美国SHELLJB公司).

1.3 动物

昆明小鼠(三峡大学动物实验中心提供),雌雄各半,体重20～25 g；SD 大鼠(三峡大学动物实验中心提供),雌雄各半,体重220～250 g,实验动物生产许可证号:SYXK(鄂)2017-0012.饲养于三峡大学动物中心SPF级动物实验室,屏障系统,饮水、摄食、光照均符合《湖北省实验动物质量控制标准》,实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2017-0061.

2 方法

2.1 湖北海棠、乌头水提物制备

湖北海棠叶、乌头块根粉碎成粗粉,分别取乌头粗粉15 g、湖北海棠叶粗粉50 g,各加入500 m L水浸泡12 h后,80℃回流提取3次,每次1 h,合并水提液,减压浓缩,0.22μm滤膜过滤,分别得到含生药质量浓度为15 mg/m L的乌头水提物、含生药质量浓度为100 mg/m L 的湖北海棠水提物(以下称海棠水提物).HPLC法测定乌头水提物中乌头碱和海棠水提物中根皮苷的含量.

2.2 乌头、海棠水提物实验用量选择

1)取50只小鼠,雌雄各半,分开适应性饲养1 d后,随机分5组,每组雌雄各10只,取2.1中乌头水提物,稀释后按15、30、60、75、100 mg/kg的乌头水提物,灌胃给药(0.1 m L/10 g),观察记录7 d内动物死亡数.

2)取30只小鼠,雌雄各半,分开适应性饲养1 d后,随机分3组,每组雌雄各10只,取2.1中的海棠水提物,稀释成3 个剂量组,质量分数分别为400、600、800 mg/kg[5],与2.2.1中60 mg/kg的乌头水提物,一起灌胃给药后,观察记录7 d内动物死亡数.

2.3 海棠水提物给药方式选择

2.3.1 中毒后给药

取20只小鼠,雌雄各半,分开适应性饲养1 d后,随机分两组,每组各10 只,先灌服乌头水提物,1 h后,其中一组灌服海棠水提物,另一组灌服等体积蒸馏水,观察7 d内动物死亡数.

2.3.2 预防性给药

取20只小鼠,雌雄各半,分开适应性饲养1 d后,随机分两组,每组各10 只,其中一组灌服海棠水提物,另一组灌服等体积蒸馏水.1 h后,两组均灌服乌头水提物,观察7 d内动物死亡数.

2.4 海棠水提物对乌头水提物血药质量浓度的影响

取40只小鼠,雌雄各半,分开适应性饲养1 d后,随机分4组,每组各10只,按预防性给药方式.海棠低、中、高剂量组分别灌服不同浓度海棠水提取,乌头组灌服等体积蒸馏水.1 h 后,各组均灌服乌头水提物,20 min后,摘眼球取血,分离血清.测定血清中乌头碱的血药质量浓度.

2.4.1 对照品溶液的配制

分别精密称取乌头碱对照品5.0、2.5、1.3、0.6、0.3 mg于10 m L容量瓶,加甲醇溶解,稀释至刻度.

2.4.2 样品溶液的配制

各组小鼠雌雄分别随机两只血清等量合并、混匀,再取100μL,加3%高氯酸溶液300μL 超声提取3次,混匀,涡旋振荡2 min,4 000 r·min-1离心10 min取上层清液,氮气吹干,用50μL甲醇溶解,HPLC法检测乌头碱浓度.

2.4.3 乌头碱标准曲线的建立

取2.4.1中的各浓度对照品溶液20μL 注入高效液相色谱仪,测定乌头碱浓度.测定条件为:色谱柱:UItimate XB-C18(5μm,4.6 mm×250 mm)；流动相∶甲醇∶水(0.1%磷酸0.1%三乙胺)=35∶65；柱温:25℃；流速:1 m L·min-1；检测器:DAD；检测波长:250 nm.计算峰面积,重复进样3次,以峰面积值对乌头碱量做标准曲线.

2.5海棠水提物对乌头中毒大鼠心电的影响

取大鼠20只,雌雄各半,分开适应性饲养1 d后,随机分5组,每组各4只.海棠水提物组灌服海棠水提物20 min后,灌服乌头水提物,阿托品组在灌胃乌头水提物后腹腔注射阿托品,乌头组灌服乌头水提物.各组灌服乌头水提物后立即麻醉.正常对照组灌服等体积蒸馏水后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,固定.连接BL-420E+生物机能实验系统,系统稳定10 min后,记录心电图[8].每组每分钟内取任意3段,计算平均心率.

2.6海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞H9c2细胞活力的影响

2.6.1 海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞H9c2培养液中乌头碱质量浓度的影响

取对数生长期H9c2心肌细胞,培养瓶培养,模型组和给药组细胞加入400μg/m L 乌头水提物,给药组再分别加入海棠水提物低、中、高剂量(20、40、80 μg/m L),空白组加入等量培养基,培养4 h,取培养液,按2.5.3处理,按2.5.4中的色谱条件进样,测定各组心肌细胞H9c2培养液中乌头碱的质量浓度.

2.6.2 海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞H9c2细胞活力的影响

心肌细胞H9c2加药处理方式同2.6.1,MTT 方法测定不同质量浓度海棠水提物(20、40、80μg/m L)对心肌细胞H9c2细胞活力的影响.

2.6.3 海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞H9c2乳酸脱氢酶(LDH)释放量的影响

取2.6.1心肌细胞培养液100μL,4℃离心10 min(1 000 r/min),取上清液10μL,按试剂盒方法测定.

2.7数据统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件对实验数据进行处理分析,组间比较采用单因素方差分析,各指标均以表示,以P＜0.05作为有统计意义.

3 结果与讨论

3.1乌头水提物和海棠水提物代表性成分含量

按2.4.3中色谱条件进样分析,计算乌头水提物中乌头碱的浓度；参考文献色谱条件进样分析[7].测得乌头水提物中乌头碱的质量浓度为0.04 mg/m L；海棠水提物中根皮苷的质量浓度为4 mg/m L.

图1乌头水提物和湖北海棠水提物HPLC图

3.2乌头水提物中毒剂量选择

通过实验确定乌头水提物100%致死量和0%致死量分别相当于原生物100 mg/kg和30 mg/kg.结果见表1.海棠水提物能降低乌头水提物中毒的死亡率,结果见表2.

表1乌头水提物致小鼠死亡率

表2海棠水提物对小鼠乌头水提物中毒死亡的影响

乌头水提物100%致死量使小鼠很快出现蜷缩,呕吐状,身体拉长,毛发湿润等疼痛表现,小鼠出现惊厥、弹跳,最终死亡.乌头水提物50%致死量引起部分小鼠出现蜷缩,呕吐状,身体拉长,最终将近半数小鼠死亡.另一半3～7 d逐渐恢复正常活动和饮食饮水.乌头水提物0%致死量引起部分小鼠出现蜷缩,呕吐状,躁动等症状,2～5 d逐渐恢复正常活动和饮食饮水,无死亡.

空白对照组:无中毒症状,正常饮食饮水,无死亡.

3.3 给药次序对小鼠乌头水提物中毒死亡的影响

预防性给药效果优于中毒后给药,结合乌头水提物中毒的100%致死量和0%致死量,选择先给予不同质量浓度的海棠水提物,再给予60 mg/kg乌头水提物.结果见表3.

3.4 海棠水提物对乌头水提物中毒大鼠心率及心肌的影响

表3给药次序对小鼠乌头水提物中毒死亡的影响

海棠水提物能改善乌头水提物中毒引起的大鼠心率失常.给药20 min乌头组出现明显心率失常,随着时间的延长,心电图显示心肌缺血进行性加重,表现为心电图Q 波越来越深,R 波丢失.海棠水提物能防治乌头水提物中毒引起的心率失常,防治乌头水提物中毒引起的心肌缺血表现,心电图未见明显心肌缺血改变,70 min后仍未见心电图出现Q 波及ST-T 等心肌缺血改变心电图.结果见表4、图2.

图2海棠水提物对乌头水提物中毒的大鼠心电图的影响

=4)表4海棠水提物对乌头水提物中毒的大鼠心率的影响

=4)表4海棠水提物对乌头水提物中毒的大鼠心率的影响

注：与空白组相比*P＜0.05,**P＜0.01；与乌头组相比#P＜0.05,##P＜0.01

组别 给药20 min给药40 min给药70 min空白组421.50±32.50##416.29±34.19 425.51±24.5##乌头(60 mg/kg)278.17±30.84**434.11±25.34 323.5±62.51*海棠低(400 mg/kg)365.54±6.50#*378.21±19.50*391.52±40.54*海棠中(600 mg/kg)463.45±20.34##468.23±29.34 434.65±6.65##海棠高(800 mg/kg)416.29±34.19##438.34±65.53 469.86±91.82##阿托品(0.5 mg/m L)429.63±19.88##431.78±30.12 419.89±20.13##

3.5乌头碱血药质量浓度的检测

以乌头碱对照品溶液的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,得到标准曲线,对测得的数据进行线性回归分析,拟合方程线性关系良好,Y=240X+0.774,其相关系数R2=0.999 1.给药20 min时,各组乌头碱血药质量浓度见表5.

表5海棠水提物对乌头碱血药质量浓度的影响s,n=4)

表5海棠水提物对乌头碱血药质量浓度的影响s,n=4)

注：与乌头组相比*P＜0.05,**P＜0.01

组别 血药浓度/(mg·m L-1)乌头0.523±0.022海棠低0.236±0.003**海棠中0.164±0.007**海棠高0.201±0.054**

海棠中剂量组乌头碱血药质量浓度仅为乌头组的30.2%,表明海棠水提物能加快乌头碱的代谢,不同质量浓度的海棠水提物对乌头碱的代谢有差异,中剂量组较低剂量组和高剂量组的影响明显.结果如图3所示.

3.6海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞H9c2细胞活力的影响

3.6.1 海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞H9c2培养液中乌头碱质量浓度的影响

按照3.5中的线性回归方程计算细胞培养液中乌头碱的质量浓度,不同组的乌头碱的含量差异不显著.见表6.

表6海棠水提物对H9c2细胞培养液中乌头碱质量浓度的影响s,n=4)

组别 血药质量浓度/(mg·m L-1)乌头0.029±0.025海棠低0.027±0.032海棠中0.026±0.006海棠高0.025±0.027

3.6.2 海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞H9c2细胞活力的影响

MTT 实验表明400μg/m L 乌头水提物能显著降低心肌H9c2细胞活力,不同质量浓度海棠水提物对心肌H9c2细胞活力无影响.中高剂量海棠水提物能显著对抗乌头水提物对心肌H9c2细胞的影响.结果见表7.

表7海棠水提物对乌头水提物中毒H9c2细胞活力的影响,n=3)

表7海棠水提物对乌头水提物中毒H9c2细胞活力的影响,n=3)

注：与空白组相比*P＜0.05,**P＜0.01；与乌头组相比#P＜0.05,##P＜0.01

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3.6.3 海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞H9c2乳酸脱氢酶(LDH)释放量的影响

乌头水提物400μg/m L作用于心肌细胞4 h后,乳酸脱氢酶活力显著升高,表明细胞膜受损.同乌头组比,海棠水提物各组乳酸脱氢酶的活力显著降低.表明海棠水提物对乌头所至心肌细胞损伤具有保护作用.见表8.

表8海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞乳酸脱氢酶的活力的影响

表8海棠水提物对乌头水提物中毒心肌细胞乳酸脱氢酶的活力的影响

注：与乌头组相比*P＜0.05,**P＜0.01

组别L LDH值/(U·L-1)空白5.99±0.22**海棠高剂量(80μg/m L)6.07±0.25**乌头(400μg/m L)12.50±0.45乌头(400μg/m L)+海棠(20μg/m L)8.73±0.32*乌头(400μg/m L)+海棠(40μg/m L)7.36±0.28**乌头(400μg/m L)+海棠(80μg/m L)7.56±0.31**

4 结论与讨论

湖北海棠水提物能有效降低乌头水提物对心脏的毒性.其作用与增强乌头中乌头碱等有毒物质代谢及直接保护心肌细胞有关.根皮苷等黄酮类化合物可能是解毒的物质基础.

预先给予海棠水提物死亡明显减少,海棠水提物(600 mg/kg)能使乌头水提物的死亡率从50%降到20%.海棠水提物能明显加强乌头中毒性物质代谢,海棠水提物(600 mg/kg)组乌头碱血药质量浓度仅为乌头组的30.2%.乌头中毒常引发严重的心律失常,海棠水提物能防治乌头中毒引起的心肌损伤,降低乳酸脱氢酶的活力,逆转Q 波及ST-T 等心肌缺血心电图的改变,改善心率失常.表明海棠水提物能有效降低乌头对心脏的毒性.

乌头是毛茛科乌头属植物,以块根入药,有川乌、草乌之分.具有良好的镇痛作用,广泛应用于风湿、关节骨病的治疗.但如果炮制或服用不当,具有心血管、神经系统及消化系统毒性[9].中毒可引发各种心律失常,严重者出现心室颤动(室颤),甚至死亡,乌头碱是其中的主要毒性成分.实验表明湖北海棠水提物能有效降低乌头对心脏的毒性.一方面可能通过促进肝脏对乌头碱等毒性物质代谢,降低心脏等靶器官中毒性物质的浓度,减轻毒性反应.另一方面改善乌头中毒引起的心肌缺血、缺氧,直接保护心肌[10].

乌头中毒无特效解毒药物,及时救治心律失常是常规解救方式.湖北海棠水提物能改善乌头中毒引起的大鼠心肌缺血、心率失常现象,显示了良好的解毒作用,表明土家族“药王昏死茶露醒”传说中茶露能解“乌头”之毒这一传说具有一定的启源依据,也进一步说明传说中的茶极有可能为湖北海棠叶.

随着对乌头类药物管理的规范,乌头中毒事件越来越少.但心血管疾病却越来越多,湖北海棠对心肌缺血、缺氧具有良好的保护作用,可进一步研究利用.