大鼠局灶性脑梗死后大脑皮质PRX6表达和MDA含量的变化

林占东，郭瑞芳，罗 凡，陈 婷，李 雪

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

大鼠局灶性脑梗死后大脑皮质PRX6表达和MDA含量的变化

林占东1，郭瑞芳2△，罗 凡1，陈 婷1，李 雪1

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

目的:观察局灶性脑梗死大鼠梗死区大脑皮质过氧化物酶6（peroxiredox6，PRX6）表达和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的变化。方法：30只雄性SD大鼠随机分为对照组和模型组，采用线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型，各组大鼠分别于术后1d、3d、7d处死取材。采用硫代巴比妥酸法检测梗死区大脑皮质MDA的含量，Western blot法和qRT-PCR法检测梗死区大脑皮质PRX6蛋白和mRNA的表达。结果：模型组各时间点大鼠梗死区大脑皮质MDA含量，PRX6蛋白、mRNA表达均明显高于对照组（P＜0.01）。随着术后时间的延长，模型组大鼠梗死区大脑皮质MDA含量逐渐降低，PRX6蛋白、mRNA表达逐渐升高（P＜0.01）。结论：大鼠脑梗死后可能通过上调PRX6的表达水平减轻氧化应激损伤。

局灶性脑梗死；过氧化物酶6；氧化应激；丙二醛

氧化应激是指机体遭受各种有害刺激（如缺血、缺氧等）时体内产生过量高活性分子(如活性氧自由基ROS等），超出自身的清除能力，从而导致脂质过氧化反应、蛋白质变性、DNA损伤等一系列病理变化[1]。大脑是对氧化应激非常敏感的器官，与其它器官相比，脑组织更容易生成活性氧并受到活性氧的攻击。已有研究表明，氧化应激是大脑缺血性损伤的重要原因[2]。过氧化物酶6（PRX6）是一种重要的抗氧化酶，功能主要是还原H2O2和磷脂过氧化物[3]。本研究通过建立局灶性脑梗死大鼠模型，观察大鼠脑梗死组织PRX6表达的变化，探讨其在大鼠脑梗死中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2012-0001。兔抗大鼠PRX6抗体，美国艾博抗（上海）贸易有限公司；辣根酶标记抗兔IgG二抗，美国KPL公司；PRX6引物，大连宝生物工程有限公司；丙二醛（MDA）测定试剂盒，中国南京建成生物公司；Trizol试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 实验动物分组及造模 30只雄性SD大鼠随机分为对照组和模型组，每组15只。参照文献[4]，模型组大鼠采用左侧大脑中动脉栓塞法制备局灶性脑梗死模型；对照组只分离血管，不栓塞结扎。模型组大鼠于造模后2h参照文献[5]的方法进行神经功能缺损评分，选1-3分的大鼠为实验对象。

1.3 取材 对照组和模型组分别于造模后1d、3d、7d（每个时间点5只大鼠）用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，30s内断头处死。模型组取左侧梗死区大脑皮质，对照组取左侧相同部位的大脑皮质，-80℃冰箱保存。

1.4 指标检测

1.4.1 检测MDA含量：取大脑皮质，裂解后匀浆，离心取上清，采用硫代巴比妥酸（TBA）法检测MDA的含量，具体操作严格按试剂盒说明书进行。

1.4.2 检测PRX6蛋白表达：采用Western blot法。取大脑皮质，匀浆后提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。蛋白上样量30μg，12% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗（1：3000）4℃过夜，二抗室温2h，漂洗后加发光液，胶片曝光。采用Image J软件分析灰度值，以目的蛋白与β-actin灰度值的比值作为PRX6蛋白的相对表达量。

1.4.3 检测PRX6 mRNA表达：采用qRT-PCR法。取大脑皮质，Trizol法提取总RNA后逆转为cDNA，于-20℃保存。PRX（6NM-053576.2）基因引物序列：上游引物，5’-CGC TTC CAC GAT TTC CTA-3’； 下游引物，5’-CAT TGA TGT CCT TGC TCC-3’。扩增反应体系内含cDNA模板1 l，2×Super Real PreMix Plus 12.5 l，上、下游引物各0.75 l，95℃预变性10min、95℃1 0s、60℃ 20s、72℃ 15s，共30个循环，末次延伸72℃10min。使用Δ Δ Ct值计算目的基因表达水平：Δ Ct=目的基因Ct值-β-actin基因Ct值，Δ Δ Ct=实验组Δ Ct-对照组Δ Ct，目的基因相对总量=2-ΔΔCt。

1.5 统计分析 应用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。服从正态分布的计量资料以（±s）表示，行析因方差分析，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对照组大鼠各时间点大脑皮质MDA含量，PRX6蛋白、mRNA表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。随着时间的延长，模型组大鼠梗死区大脑皮质MDA含量逐渐降低，PRX6蛋白、mRNA表达逐渐升高，两两比较差异具有统计学意义（P＜0.01）；相同时间点比较：模型组各时间点大鼠梗死区大脑皮质MDA含量，PRX6蛋白、mRNA表达均明显高于对照组同时间点（P＜0.01）。见附表：

附表 各组大鼠大脑皮质MDA含量和PRX6蛋白、mRNA表达情况（±s，n=5）

附表 各组大鼠大脑皮质MDA含量和PRX6蛋白、mRNA表达情况（±s，n=5）

与对照组同时间点比较：aP＜0.01；与模型组1d组比较：bP＜0.01；与模型组3d组比较：cP＜0.01

组别和时间点 MDA含量（mmol/mg蛋白）PRX6蛋白 mRNA对照组1d 3.94±0.16 0.575±0.011 1.000 3d 3.97±0.21 0.571±0.012 1.000 7d 3.99±0.25 0.583±0.009 1.000 1d 12.64±0.60a 0.644±0.009a 1.091±0.015a3d 8.99±0.36ab 0.858±0.029ab 1.268±0.032ab7d 6.76±0.24abc 1.085±0.034abc 1.397±0.016abc模型组

3 讨论

当组织缺血、缺氧时，会导致大量ROS的产生，ROS过量可引起脂质、蛋白质和DNA等重要细胞成分氧化，最终导致细胞损伤甚至死亡[6]。脂质过氧化物中MDA的毒性最大，其含量可作为反应组织过氧化损伤程度的客观指标[7]。本研究发现，与对照组比较，模型组各时间点大脑皮质MDA的含量明显升高，说明脑缺血可造成大鼠脑组织损伤并诱发了脑组织氧化应激反应。

过氧化物酶6（PRX6）是含有1个Cys残基的Prx单体，具有过氧化物酶和磷脂酶A2活性双重功能，有抗氧化和清除ROS的作用[8]。PRX6与过氧化物反应过程中其Cys残基被氧化，而氧化的Prx6 Cys残基可被谷胱甘肽还原，参与过氧化物的还原过程[9]。本研究发现，与对照组比较，模型组各时间点PRX6蛋白和mRNA的表达均明显升高，并且随着造模时间的延长，PRX6蛋白和mRNA的表达逐渐显升高、MDA的含量逐渐降低，提示脑缺血时机体启动了内源性保护机制，从而能减轻氧化应激损伤。

综上所述，大鼠脑缺血时，大脑皮质PRX6的表达明显升高，并且随着缺血时间的延长PRX6的表达水平逐渐升高，提示脑缺血可启动机体的内源性保护机制，从而减轻氧化应激损伤。因此，通过上调PRX6的表达水平减轻氧化应激损伤，可能为改善脑梗死患者的预后提供新思路。

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[4]常红，黄国伟，刘莉，等.大鼠大脑中动脉栓塞模型的建立[J].天津医科大学学报，2007，1（33）：327-329，359.

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CHANGES OF PRX6 EXPRESSION AND MDA CONTENT IN CEREBRAL CORTEX OF RATS AFTER LOCAL CEREBRAL INFARCTION

LIN Zhan-dong, GUO Rui-fang, LUO Fan, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the changes of peroxiredox6 (PRX6) expression and malondialdehyde (MDA) content in cerebral cortex of rats after local cerebral infarction. Methods: 30 male SD rats were randomly divided into control group and model group. Suture method was used to establish middle cerebral artery occlusion rats’ model, and the rats were killed respectively 1d, 3d, 7d after operation. Thiobarbituric acid method was used to detect the MDA content in cerebral cortex, Western blot and qRT-PCR to detect PRX6 protein and mRNA expression in cerebral cortex. Results: The MDA content and PRX6 expression in infarct area of cerebral cortex of rats in model group at each time point were obviously higher than control group (P＜0.01). With time extension after operation, the MDA content declined gradually, while the PRX6 expression increased gradually (P＜0.01). Conclusions: After cerebral farction, the rats may reduce oxidative stress injury by upregulating PRX6 expression.

Local cerebral infarction; PRX6; Oxidative stress ; MDA

R363.2

A

1004-6879（2017）03-0188-03

2016-10-01）

△ 通讯作者