高效液相色谱—串联质谱测定4种植物生长延缓剂在6种根及根茎类药材中残留量

翟宇瑶+郭宝林

[摘要] 建立了适用于根及根茎类药材中同时测定多效唑、丁酰肼、矮壮素和缩节胺4种植物生长延缓剂残留量的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS-MS）测定方法。根类药材样品分别经含0.1%甲酸的乙腈混合液提取两次，混合提取溶液经Waters Atlantis HILIC色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.0 μm）分离，用含0.1%甲酸的0.005 mol·L^-1醋酸铵溶液-甲醇-乙腈（13∶15∶72）等度洗脱，采用电喷雾正离子模式多反应监测。4种植物生长延缓剂在6～1 500 μg·kg^-1线性良好，相关系数为0.997 8～0.999 9；加样回收率为79.3%～103.3%，相对标准偏差（RSD）均不大于11%。在检测的麦冬、当归、牛膝、泽泻、川芎和三七等药材中，4种植物生长延缓剂在其中部分药材中有检出，其中较为严重的情况是，麦冬的多效唑检测量为63.4～1 351.6 μg·kg^-1，麥冬、泽泻、川芎、当归4种药材中检测到丁酰肼。

[关键词] 高效液相色谱-串联质谱法；根类药材；植物生长延缓剂

[Abstract] HPLC-MS/MS was applied to the determination of residual amount of plant growth retardant such as paclobutrazol，daminozide，chlormequat and mepiquat chloride in dried root and rhizome herbs. The sample was extracted twice with acetonitrile containing 0.1% formic acid. The separation was performed on a Waters Atlantis HILIC column with an elution system consisting of acetonitrile-5 mmol·L^-1 ammonium acetate solution with 0.1% formic acid，methanol and acetonitrile. The MS spectrum was acquired in positive mode with multiple reactions monitoring （MRM）. The linear range was 6-1 500 μg·kg，and the optimized method offered a good linear correlation （r>0.997 8），excellent precision （RSD<11%） and acceptable recovery （from 79.3% to 103.3%）. Four kinds of plant growth retardant have detected in some of these herbs like Ophiopogonis Radix，Angelicae Sinensis Radix，Achyranthis Bidentatae Radix，Alismatis Rhizoma，Chuanxiong Rhizama and Notoginseng Radix et Rhizama，is among the more severe cases，dwarf lilyturf，multi-effect azole detection quantity is 63.4～1 351.66 μg·kg^-1，and Daminozide was detected in Ophiopogonis Radix，Angelicae Sinensis Radix，Chuanxiong Rhizama，Alismatis Rhizoma.

[Key words] HPLC-MS/MS；dried root herbs；plant growth retardant

植物生长延缓剂（plant growth retardant，PGR）是植物生长调节剂的一类，进入植株体内，主要是通过抑制赤霉素的合成抑制植物地上部分的营养生长，从而具有抗倒伏、促分蘖等作用，同时可促进营养向果实和根部转移，而提高果实和根部产量[1]。本研究组在药用植物种植产地调查发现，该类植物生长调节剂已经在几种根及根茎类药材种植过程中大量使用[2]。本文作者在道地药材主产区调查中发现多效唑（paclobutrazol）、烯效唑（uniconazole）、丁酰肼（daminozide）、矮壮素（chlormequat chloride）、缩节胺（mepiquat chloride）、氯化胆碱 （choline chloride）等6种植物生长延缓剂在根和根茎类药材种植过程中使用较多。

目前使用的大部分植物生长延缓剂的毒性为低毒或微毒，不合理使用会导致其在农产品中残留，从而影响食用者的健康。例如丁酰肼（比久）的水解产物非对称二甲基联氨具有致癌的作用[3]。欧盟、日本、澳大利亚等国已制定了水果，蔬菜及农作物中多种植物生长延缓剂的限量。其中，欧盟、日本、澳大利亚对多效唑在猕猴桃上的残留限量分别为 0.02，0.01，0.01 mg·kg^-1；日本规定丁酰肼在任何食物中不得检出，在番茄中矮壮素和缩节胺的最大残留限量分别是0.05，0.01 mg·kg-1 [4-10]。但对于中药材中植物生长延缓剂的残留限量规定国内外尚是空白，实际上，植物生长调节剂被发现广泛用于药用植物种植中，因此，在药材中的限量必须受到重视。本文将首次检测多效唑、丁酰肼、矮壮素、缩节胺4种在其他作物中具有残留限度要求的延缓剂在麦冬、三七、泽泻、川芎、牛膝、当归6种药材中的残留量。

植物生长延缓剂残留量的检测方法包括传统分析方法（化学法、电位滴定法）和色谱法（气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等），其中 LC-MS/MS 以其可检测成分微量准确的特点，已成为检测农药残留的主要方法。本文建立了一种高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），用于检测药材中多效唑，丁酰肼，矮壮素，缩节胺成分，此方法可为中药材中植物生长延缓剂残留的检测提供技术手段。

1 材料

Agilent1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），API3200Q-trap质谱仪（美国应用生物系统公司），KQ-100DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），0.45 μm 有机相滤膜（上海安谱科学仪器有限公司），乙腈（色谱纯，Honeywell Burdick & Jackson，韩国 SK Chemicals 公司），甲醇（分析纯，西陇化工股份有限公司），多效唑（P109932-250 mg分析对照品，纯度>99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司），矮壮素（C114434-250 mg分析对照品，纯度>97.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司），丁酰肼（B9）（D105966-250 mg分析对照品，德国Dr.Ehrenstorfer公司），缩节胺（00812，纯度>99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司），甲醇（Fisher色谱纯），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2013年在6种药材的道地药材产区，见表1。每种药材随机收集5份，每份不少于1 kg，每份药材全部粉碎后混合均匀后取样。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称定各对照品5 mg，用乙腈定容至5 mg量瓶中，配制成质量浓度为1 g·L^-1的标准储备液，然后用乙腈稀释成所需的适当质量浓度的混合标准溶液，于棕色试剂瓶中保存。

供试品溶液的制备：精密称取样品粉末（过60目筛）2 g，置于具塞离心管中，精密加入含0.1%甲酸的20 mL乙腈提取液，旋涡混匀30 s，超声 （功率450 W，频率59 kHz） 30 min，以3 000 r·min^-1离心10 min后，室温静置，取上清液。下层残渣再加入10 mL 乙腈重复提取 1次，合并2次上清液。取上清液，用0.45 μm有机相滤膜过滤后，进样5 μL，供HPLC-MS-MS分析。

2.2 色谱条件 Waters Atlantis HILIC色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.0 μm），柱温25 ℃，流速0.4 mL·min^-1，进样量5 μL，流动相与洗脱条件0.1%甲酸的0.005 mol·L^-1醋酸铵溶液-甲醇-乙腈（13∶15∶72），电离方式：电喷雾（ESI +），喷雾电压5 000 V，毛细管温度450 ℃；鞘气2.06×10⁵Pa；辅助气15 mL·min^-1，化合物质谱采集参数见表 2，在上述色谱条件下，对照品溶液的色谱图见图 1。

2.3 线性关系考察 4种植物延缓剂采用基质匹配-外标法定量分析。用空白麦冬样品提取液配制不同浓度范围的植物生长调节剂混合标准溶液，以浓度为横坐标（X，μg·kg^-1），定量离子对峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归计算，所得相关系数均大于0.99，线性关系良好，见表3。以3倍信噪比估算检出限（LOD），以10倍信噪比对应浓度作为定量限（LOQ），4 种植物生长延缓剂的检出限在1.5～3.8 μg·kg^-1，定量限在6～15 μg·kg^-1。

2.4 精密度试验 取一定质量浓度的混合对照品溶液，连续进样6次，记录色谱峰的面积，计算4种植物延缓剂多效唑，丁酰肼，矮壮素，缩节胺的峰面积，得RSD分别为1.4%，0.80%，1.4%，1.0%；连续进样3 d，每天6次，记录峰面积，以上4种指标成分日间精密度分别为1.2%，0.70%，1.5 %，1.1%，表明精密度良好。

2.5 重复性试验 精密称取麦冬1供试品粉末6份，每份2.0 g，按2.1项方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进行测定。结果表明：样品中4种植物延缓剂多效唑，丁酰肼，矮壮素，缩节胺含量测定的RSD分别为1.3%，1.0%，1.5%，2.0% （n=6）。

2.6 稳定性试验 制备供试品溶液和对照品溶液各一份，于制备完成后的0，2，4，6，8，10 h分别进样，测定峰面积。4种植物延缓剂（多效唑，丁酰肼，矮壮素，缩节胺）对照品溶液的RSD分别为1.4%，1.7%，1.1%，0.6% （n=6）。供试品溶液的RSD分别为1.8%，1.5%，1.2%，1.6% （n=6）。结果表明供试品溶液和对照品溶液在制备后10 h内稳定。

2.7 加样回收率试验 以麦冬、三七、泽泻、川芎、牛膝、当归6种中药材为样品，对4种植物延缓剂（多效唑，丁酰肼，矮壮素，缩节胺）进行50，100，200 μg·kg^-13个水平的加样回收率和精密度实验。6种中药材中4种植物生长延缓剂的3个添加水平的回收率为79.3%～103.3%，相对标准偏差（RSD）均不大于11%，具体数据见表4。

2.8 样品含量测定 按2.1项方法分别制备对照品溶液及药材供试品溶液，按上述色谱条件测定，采用峰面积外标法，计算4种植物延缓剂（多效唑，丁酰肼，矮壮素，缩节胺）的含量。每批样品平行2份，每个溶液进样3次，结果见表5。典型样品中4种植物生长延缓剂的MRM图谱见图2。

从分析结果可以看出：这6种中药材中都检测出一种或以上的植物生长调节剂，这表明植物生长延缓剂被广泛应用于中药材生产中。多效唑在麦冬、泽泻、三七、川芎中有检出，其中5个麦冬样品中全部含有多效唑残留，检测量为63.4～1 351.6 μg·kg^-1，个别样品高于水果蔬菜等农产品中有关多效唑的最大残留限量200（菜籽油）～500（小麦、苹果、荔枝、稻谷）μg·kg^-1。4个川芎样品含有多效唑残留，检测量为10.0～21.0 μg·kg^-1。麦冬、泽泻、川芎、当归中检测到丁酰肼的残留，其中2个麦冬样品中丁酰肼的残留量为40.4 μg·kg^-1，80.9 μg·kg^-1，4个当归样品中残留的丁酰肼为13.4～20.2 μg·kg^-1，而我國规定花生种不得检出丁酰肼。麦冬、泽泻中检测到了矮壮素残留，残留量为22.9 ～55.7 μg·kg^-1，矮壮素在我国的最大残留限量为500（棉籽）～5 000（小麦、玉米）μg·kg^-1。缩节胺只在5个麦冬样品中有残留，残留量为19.1～83.2 μg·kg^-1，目前我国关于缩节胺的残留标准无相关规定，但其残留量远远低于缩节胺在日本的最大残留限量2 000 μg·kg^-1。

3 讨论

3.1 质谱条件的优化 采用针泵进样分析化合物的标准溶液（0.1 mg·L^-1），离子源为电喷雾电离源，多反应监测模式下对植物生长延缓剂的质谱条件进行优化。多效唑和丁酰肼进入一级质谱后，易产生稳定的[M+H]+分子离子，矮壮素，缩节胺进入一级质谱后，很容易产生稳定的[M+Cl]-分子离子。最终确定多效唑的母离子为m/z 294.5，丁酰肼的的母离子为m/z 161.3，矮壮素的母离子为m/z 122.1，缩节胺的的母离子为m/z 114.4。

[M+H]+和[M+Cl]-母离子在质谱二级裂解时，可发生重排、断裂等裂解相关反应，而生成不同质量数的碎片离子。设定质谱二级裂解时碎片离子的扫描范围，从 50 amu 到比母离子大20 amu，监测其变化情况。[M+H]+（m/z 294.5）作为多效唑的母离子，产生有显著丰度的m/z 70.2及m/z 125.3等离子碎片，其中m/z 70.2丰度最高。因此，选择m/z 294.5→70.2作为定量离子对，其他作为定性离子对。丁酰肼的定量离子对分别为m/z 292.5→70.2，161.3→143.2[M+Cl]-（m/z 122.1）作为矮壮素的母离子，很容易在质谱二级裂解时，发生α断裂，i 断裂及氢重排，产生有显著丰度的m/z 58.2 离子和m/z 63.1 离子碎片，其中m/z 58.2丰度最高。因此，选择m/z 122.1→58.2 作为定量离子对。这与Ondrej Lacina，张洪霞等的相关报道相一致[18-19]。缩节胺分子的质谱裂解规律相类似，同理得出[M+Cl]-离子即m/z 114.1为缩节胺母离子，定量离子为m/z 98.2。具体的裂解图谱见图3，4。

3.2 色谱柱的选择 4 种植物生长延缓剂虽然分子结构相似，如缩节胺，矮壮素分子结构十分相近，但结构与性质差别较大，并且含有不同的元素。原则上MRM模式分离不需要所有峰达到基线分离，但若分离效果差，容易导致离子相互作用，影响定量结果。因此，选择色谱柱至关重要。本文分别比较了Waters的Atlantis HILIC（2.1 mm×150 mm，3.0μm），Thermo的Hypersil GOLD aQ（4.6 mm×150 mm，5.0 μm），Agela的Venusil HILIC （2.1 mm×150 mm，3.0 μm），3种色谱柱对4种植物生长延缓剂的分离效果。结果表明，Atlantis HILIC（2.1 mm×150 mm，3.0 μm）色谱柱对4种植物生长延缓剂的分离效果最好，因此本研究以其作为分离柱。4种植物生长的MRM色谱图见图1。

3.3 流动相条件的优化 由于流动相的组成和pH直接影响化合物的色谱行为及其质谱响应值，所以本文考察比较了不同流动相配比时目标化合物的分离情况。当流动相为水-乙腈（28∶72）时，缩节胺不能达到基线分离。在HILIC色谱柱中甲醇为较水弱的洗脱溶剂，当流动相中加入15%甲醇时，5种化合物基线分离，但缩节胺，矮壮素，丁酰肼出现峰拖尾。随着向流动相中加入乙酸的浓度增大，流动相pH减小，色谱峰拖尾现象改善。因此，最终选择0.1%甲酸的5 mmol·L^-1醋酸铵溶液-甲醇-乙腈（13∶15∶72）为色谱洗脱条件。

3.4 提取溶剂的选择 实验比较了4种植物生长延缓剂加标浓度为100 μg·kg^-1时，不同的提取溶剂对4种植物生长延缓剂的提取效果，每种基质每种提取溶剂做3个平行样，提取效果见表6。结果表明，4种植物生长调节剂在6种不同基质中回收率在在85.4%～117.6%，由于乙腈提取可避免样品基质中蜡质，脂肪和脂溶性色素的干扰，降低提取液中杂质的含量，提高目标物的回收率，所以本实验选择乙腈作为提取溶剂[11]。

3.5 药材中的残留情况 根据检测结果可以发现4种植物生长延缓剂在麦冬中药材中的残留最为严重，这反映了麦冬种植过程中使用几种延缓剂的强度很大，其中最严重的是多效唑[2]，一年喷洒多次，另外麦冬是连作植物，一个地块收获以后，仍旧继续种植，土壤中的残留会继续累加作用于植物，因此麦冬亟待建立几种延缓剂的残留标准。

从产地调研不同药材中使用植物生长延缓剂（俗称“壮根灵”）的情况看，除了麦冬，使用比较严重的还有泽泻、牛膝，当归次之，川芎和三七较少[2]，从残留检测结果看，除了麦冬，只有当归中检测出丁酰肼，其他几种延缓剂有检出，但是残留量不高，一方面可能使用强度不大，另一方面也可能是本研究的取样量比较少。当然对于泽泻来说，虽然使用比较严重，但是泽泻是水生植物，不容易产生残留。因此，药材中植物生长延缓剂的残留问题仍是值得深入研究也需要引起社会的广泛关注。

3.6 建立药材残留标准的建议 中药材由野生转为种植是保证药材供应的必要手段，也是中医药产业发展的必然趋势。本研究组经过调查发现植物生长延缓剂已经成为部分根和根茎类药材增产的常规手段，除了本文报道之外[2]，还有白术、白芍等常用药材，但植物生长延缓剂对中药材质量的影响复杂，也缺乏相关基础研究，应禁止单纯以增加药用器官产量为目标的使用，与此同时，为了实现有效的监管，有必要对该类成分在中药材中的残留导致的安全性进行风险评估，并建立相应的残留标准。

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[责任编辑 丁广治]