十字花科蔬菜根肿病菌侵染寄主组织学观察

苏子毅，班洁静

(1.湖北省水果湖高级中学，湖北 武汉 430071；2.华中农业大学植物科技学院，湖北 武汉 430070)

十字花科蔬菜根肿病菌侵染寄主组织学观察

苏子毅1，班洁静2

(1.湖北省水果湖高级中学，湖北 武汉 430071；2.华中农业大学植物科技学院，湖北 武汉 430070)

十字花科蔬菜根肿病是影响该类蔬菜的重要病害，有效地防治十字花科蔬菜根肿病是对该类蔬菜生产的产量和品质具有十分重要的意义。通过该病害在湖北田间发病情况的调查，在实验室对该病害发病过程情况的观察、了解、分析，从而为该类蔬菜抗病品种的鉴定及该类蔬菜病害防治化学药剂的筛选提供科学根据。

蔬菜；十字花科；根肿病

由芸薹根肿菌(plasmodiophora brassicae Woron)侵染引起的十字花科蔬菜根肿病是影响蔬菜产量和品质的重要病害，生产上一旦发病就难以有效防治。结合该病在湖北省发生的危害，在田间调查的基础上，通过室内人工接种，显微镜下观察了病菌侵染过程及组织学变化，以期为病害的早期防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株及来源

供试菌株为芸薹根肿菌4号小种，由华中农业大学植物病理室提供。

1.1.2 蔬菜品种

供试品种为新选早熟5号小白菜。

1.2 试验方法

1.2.1 感病寄生症状观察

在根肿病大田发病期间，通过对长阳县火烧坪十字花科蔬菜根肿病田间发生危害情况的调查，结合室内盆栽试验，进一步观察了本病的主要症状特点。

1.2.2 根肿菌休眠孢子的提取

根肿组织用自来水洗干净，7%乙醇表面消毒 30s，加入无菌水充分研磨，经8层纱布过滤，装入50mL离心管中，500rpm离心15min，弃上清，转入新离心管中，400rpm离心10min，加15mL 50%蔗糖溶液混匀，2500rpm离心10min，弃上清，移入新离心管中，加灭菌水至35mL，4000rpm离心10min，沉淀溶于30mL灭菌水，4000rpm离心10min，重复两次。沉淀重新溶于50mL无菌水中，获得休眠孢子悬浮液。

1.2.3 供试品种幼苗培养及接种

幼苗培养：采用沙-营养液培养供试品种新选早熟5号小白菜幼苗。普通沙粒经过过滤筛过滤，过滤后的沙粒大小为30～50mm，分别装入50mL有机玻璃离心管中，然后加入改良的hoagland营养液40mL(表1)，调节pH为5.0 .

表1 营养液配方

幼苗接种：预先提取的根肿菌休眠孢子悬浮液，基质为经过筛的沙粒，将改良后的营养液装入50mL有机管内，然后将培养的发芽幼苗植入填充沙粒5mL吸头中，在幼苗周边接种休眠孢子悬浮液，最后置于离心滤架内种植(图1)。以未接种的幼苗为对照。

图1 供试品种幼苗培养情况

1.2.4 根肿菌休眠孢子萌发观察

制备的根肿菌孢子悬浮液，接种前用地衣红染色，观察休眠孢子萌发情况。将冰醋酸45mL装入锥形瓶中加热煮沸，然后加地衣红1g，冷却后加蒸馏水55mL振荡，过滤备用。染色后的休眠孢子在光学显微镜下观察孢子的萌发动态，供接种用。

1.2.5 根肿菌侵染组织的石蜡切片

发病根组织与健康对应组织按下列程序进行切片。

1)固定 分别切取病健组织→FAA中固定2h，使固定液侵透根组织：

2)脱水与透明 从固定液中取出根组织→70%酒精(2h)更换3次→80%酒精(过夜)→85%酒精(2h)→95%酒精+伊红(2h)→100%酒精(1h)→1/2酒精+1/2二甲苯(1h)更换2次→二甲苯(1h)更换2次。

3)渗蜡 取出脱水透明的根组织置于蜡杯中→加入2/3的碎石蜡(熔点48°～50°)用盖子盖好→37°～40°温箱中溶蜡(24h)移去杯盖，置于56°恒温箱3d，使透明剂充分发挥→取若干小杯放入溶点为60°～62°的石蜡→将根组织转移到杯中→置70°恒温箱中，间隔2h更换一次石蜡，连续3次。

4)包埋 用硬质纸折叠成2cm×2cm×1cm的纸盒→纸盒中倒入石蜡→将小杯中的根组织转移到纸盒中，竖直排列→待石蜡稍凝固后置于清水彻底冷却凝固。

5)修蜡与切片 包埋的根组织蜡块用刀片切割成梯形→将梯形蜡块固定在木台上→小木块固定于切片机上→设置切片厚度为8mm，切片时保持连续性，使切出的小片成一片完整的蜡带。

6)粘片与烘片 在载玻片上均匀涂抹粘片剂→滴上蒸馏水→选择完好的蜡带地域小段置于载玻片上→置放在恒温展片台上烫片，蜡带充分烫平烘干→载玻片置31°恒温箱中1d。

7) 脱蜡及染色 100%二甲苯(20min)→1/2二甲苯+1/2酒精(2S)→100%酒精(2S)→95%、 85% 、50%酒精(2S) →1%甲苯胺蓝染液(30min)→蒸馏水(2S)。

8)封片观察 用盖玻片盖好后置入普通光学显微镜下进行观察。

1.2.6 醋酸苯胺蓝与醋酸洋红染色根毛侵染观察

将苯胺蓝溶于50%醋酸中，配制成浓度为125mg/L的染液，对接种后不同时期的幼苗进行根毛染色，显微镜下观察根肿菌侵染过程。

称取洋红粉末1g，倒入100mL 45%的醋酸溶液中，容器中煮沸(30s)冷却后过滤。醋酸洋红染色的根毛，徒手切片，显微镜下观察根肿菌皮层侵染动态。

1.3 主要试剂与设备

试剂：地衣红，苯胺蓝，洋红，醋酸，MES，蔗糖，酒精等；

设备：均浆机，pH计，显微镜，切片机，培养箱，电子天秤等。

2 结果与分析

2.1 十字花科蔬菜根肿病症状

通过对长阳县火烧坪高山蔬菜实地调查根肿病发生危害状况，结合室内盆栽接种对病害症状的观察，感病植物地上和地下均表现出明显症状特征。

在大田发病期间，根肿病的主要症状表现为感病植株生长迟缓，较正常植株矮小，叶片发黄。重病田块病株萎缩，甚至死亡，拔起后可见大小不等的肿瘤，根系腐烂(图2)。

图2 十字花科蔬菜根肿病大田发病症状

室内盆栽接种试验，感病幼苗根系变褐，白色新根明显少于健株，30d后病株主根和侧根可见形成十分明显的肿大(图3)。

2.2 根肿菌休眠孢子的显微观察

对供接种用提取制备的根肿菌休眠孢子悬浮液，在相差显微镜下观察孢子的形态特征和萌发情况。病菌休眠孢子为近圆形，表面不平滑，有突起(图3A)。用醋酸地衣红染色，可见未萌发的孢子染成红色，萌发的孢子不能着色，呈空孔(图3B)。根据对休眠孢子萌发的观察，为人工接种观察病菌侵染寄主的组织学变化提供了依据。

图4 根肿菌休眠孢子形态及醋酸地衣红染色

2.3 根肿菌侵染寄主的组织学观察

通过对感病寄主和健康植株根组织石蜡切片、光学显微镜进行比较观察，受根肿菌侵染的植株下胚轴横切面层次明显紊乱，皮层中柱等区间界限模糊不清，原质团分布于组织内(图4B)，而健康根组织各层次结构分明(图4A)。

图5 感病组织和健康组织层次结构变化比较

从图5可以看出，根肿菌侵染寄生后，破坏了根组织的正常结构，从而影响寄主根组织的正常发育，随着病菌在组织中不断扩展，对植株的破坏性进一步加重，导致地下和地上部分出现不同病害症状。

图6 感病寄主根肿菌根毛侵染动态

利用沙——营养液法培育感病幼苗，接种后不同时间段取样，使用苯胺蓝对根毛进行染色，显微镜下可见根肿菌首先聚集到根毛周围(图6A)，其后，进入根毛内形成初级原生质团(图6B)，进而形成游动孢子囊(图6C，D，F)，随后次级游动孢子释放(图6H)，并伴随对皮层的初期侵染(图6E，G)。

采用醋酸洋红对根系组织进行染色，观察根肿菌侵染皮层动态。结果显示，病菌次级游动孢子侵染根系后，不断分裂，形成不定型变形体—次级原生质团(图6A)，侵染后期原生质团分化形成圆形或近圆形休眠孢子囊，充满整个寄主细胞(图6B)，寄主死亡腐烂后，休眠孢子囊释放出休眠孢子，成为下次侵染的初侵染源。

图7 感病寄主根肿菌皮层侵染情况

通过不同方法对根肿菌侵染寄主的组织学观察，揭示了病菌侵染寄主的动态过程，及对根系组织的破坏作用。这一结果为进一步研究根肿菌在活体寄主中的侵染、发育与致病等提供了参考。

3 小结与讨论

十字花科根肿病是严重影响蔬菜产量和品质的重要土传病害，不同十字花科蔬菜品种感病后，最典型的症状是根部形成肿瘤，随着病情的进一步扩展，感病植株生长发育受阻，地上部分出现萎焉，严重时甚至枯死。 采用室内人工接种方法培养小白菜幼苗，不同时期取样，显微观察结果显示，土壤中根肿菌的休眠孢子，首先附着在寄主根系周围，进而萌发侵入根系皮层组织，并完成整个侵染发育过程。与此同时，伴随病菌在根组织中的发育，根组织的正常结构受到破坏。

通过对感病幼苗根组织进行切片，显微镜下可见受根肿菌侵染幼苗的根系皮层组织各层次结构不清，而健康幼苗根结构层次分明。由此说明，根肿菌在对寄主根系的侵染过程中，不仅从根组织中获取维持生长发育的各种养分，而且病菌分泌的某些化学物质，破坏寄主的正常代谢，从而在根部出现肿瘤，影响养分和水分的运输，导致生长后期地上部焉萎或植株死亡。

十字花科作物根肿菌是一种尚不能进行人工培养的专性寄生菌，相较于其他植物病原菌，根肿菌的生活史某些生物学特性等方面的研究，在一定程度上受到很大限制。因此，探索和创新实验技术方法，对根肿菌病系学研究和病害防控等均具重要意义。

本试验结果，初步揭示了根肿菌的侵染与发育及对寄主组织学的破坏，人工接种试验采用的相关技术方法，对根肿菌病原学研究、抗病品种鉴定及防病化学药剂的筛选等，具有一定参考借鉴作用。有关根肿菌侵染不同十字花科作物寄主的组织学与生理学变化，病菌与寄主的互关系有待进一步研究。

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[3]王 靖，黄 云．十字花科根肿病研究进展[J]．植物保护，2011,37(6):153～158．

[4]肖崇刚，郭向华．甘蓝根肿病菌的生物学特性研究[J]．菌物系统，2002,21(4):597～603．

2016—12—18

苏子毅(1999— )，男，湖北广水人，曾获第29届湖北省青少年科技创新大赛创新成果一等奖.

班洁静，Email：448973503@qq.com，现工作单位：国家知识产权局专利局专利审查协作湖北中心.

Q93

A

2096-3149(2017)01- 0040-05

10.3969/j.issn.2096-3149.2017.01.009