柳叶白前多糖、醇溶性浸出物含量测定与相关性分析

潘晨曦 陈健苗 吕伟旗

·药学研究·

柳叶白前多糖、醇溶性浸出物含量测定与相关性分析

潘晨曦 陈健苗 吕伟旗

柳叶白前；多糖；浸出物；相关性分析

柳叶白前系萝藦科植物柳叶白前Cynanchum stauntonii（Decne.）Schltr.ex.Levl.的干燥根茎，是2015版《中国药典》收录的两种白前药材之一，产于安徽、江苏、浙江、湖南、江西、福建、广东、四川、广西和贵州等省区，性辛、苦、微温，具有降气，消痰，止咳的功效，用于肺气壅实，咳嗽痰多，胸满喘急[1-3]。柳叶白前现有研究主要集中在根部挥发油、甾体类等成分分离鉴定及其抗菌、抗病毒等药理药化作用，药材伪品生药学鉴定与高效优质栽培技术研究等方面，对不同产地柳叶白前种质资源收集与评价工作鲜有报道[4-9]。药用植物中提取的多糖具有抗肿瘤、抗病毒、提高免疫力，抗氧化等多种功效，研究表明柳叶白前根部醇提物具有镇咳平喘、镇痛抗炎、抗血栓形成等作用[10-14]，因此本试验收集全国柳叶白前主分布区18个种质资源，以多糖与醇溶性浸出物为含量指标，分析其与产地、经纬度、海拔、农艺性状间的相关性，以期为柳叶白前种质资源质量评价与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料2013年11月—2014年1月，收集浙江、江西、福建等省柳叶白前种质资源18份，2014年3月将收集的种子统一播种，同年5月待苗高15 cm左右时统一移栽于我院中药材种质资源圃，常规大田水肥管理。原植物由陈健苗副主任药师鉴定为萝藦科植物柳叶白前C.Stauntonii，见表1。

1.2 仪器与试剂Milli-Q Academic超纯水仪（美国Millipore公司）；UV2550紫外-可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；DK-S24型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；DGG-9070型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；DSH-9070型高温干燥试验箱（杭州蓝天化验仪器厂）；GT16-3型高速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）；FA1004B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。D（+）-无水葡萄糖（B21882）购自上海源叶生物科技有限公司；重蒸酚（909C024）购自北京索莱宝科技有限公司，浓硫酸（81007）购自深圳市冠泰化工有限公司，其它试剂均为分析醇。

表1 供试柳叶白前种质资源

1.3 试验方法

1.3.1 农艺性状考察2015年10月考察农艺性状，每个处理随机选取15株，用卷尺与游标卡尺测量株高、茎粗、叶长、叶宽、根状茎长、根状茎直径与根状茎节间长，计算叶长宽比=叶长/叶宽，叶长宽积=叶长×叶宽；采挖地下根状茎，以10m2小区所有植株地下根状茎干重为产量指标，试验平行3次。

1.3.2 多糖与浸出物含量测定

1.3.2.1 样品溶液制备与含量测定多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，参考2015版《中国药典》[1]：精密称取柳叶白前粉末0.3g，加蒸馏水200mL，沸水浴回流提取3h，趁热过滤定容至250mL，精密吸取5mL，加25mL无水乙醇，4℃放置1h，4000rpm离心1h，倒去上清，加80%乙醇20mL，4000rpm离心30min，重复1次，沉淀定容至50mL。取样品溶液1mL，加5%苯酚溶液1mL，浓硫酸5mL，摇匀冰浴放置5min，沸水浴20min，冷却至室温，于488nm处测定吸光度，以蒸馏水为对照，试验平行3次。

醇溶性浸出物含量测定采用热浸法，参考2015版《中国药典》[1]：精密称取柳叶白前粉末2.0g，加95%乙醇50mL，密塞称重得质量b，放置1h，80℃加热回流提取1h，补差重，精密量取滤液25mL置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后105℃干燥3h，干燥器内冷却称重得质量a，计算浸出物含量=（a－b）×

1.3.2.2 线性关系考察精密吸取0.1mg/mL葡萄糖标准品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1/mL，蒸馏水补足2mL，按照“1.2.2.1”方法测定吸光度，以吸光度为纵坐标Y，浓度为横坐标X，绘制标准曲线，本试验线性方程为Y=13.856X－0.0166，R2=0.9997，浓度范围为0.005～0.05mg/mL。

1.3.2.3 稳定性试验取浙江松阳样品，在“1.3.2.1”方法下制备样品溶液，室温避光保存，分别在0、1、2、4、8、12、24h测定OD值，计算RSD为1.21%，供试多糖样品溶液在室温避光保存24h稳定。

1.3.2.4 重复性试验取浙江松阳样品6份，在“1.3.2.1”方法下制备样品溶液与测定多糖含量，得样品平均多糖含量为8.13%，RSD为2.27%，试验方法重复性良好。

1.3.2.5 精密度试验取浙江松阳样品溶液，按“1.3.2.1”方法下连续测定6次吸光度，得RSD为0.17%，表明仪器精密度良好。

1.3.2.6 加样回收率试验取浙江松阳样品适量，加入葡萄糖标品，在“1.3.2.1”方法下制备样品溶液，配制成80%、100%、120%的低、中、高3个浓度梯度分别测定多糖含量，计算加样回收率（%）=（C-A）/B× 100%，A为样品多糖含量，B为加入标准品含量，C为实际测得量，试验平行3次，得平均加样回收率与RSD值，见表2。

1.3.2.7 数据处理应用SPSS17.0与DPS9.05软件处理数据，采用单因素ANOVA分析，聚类分析采用类平均法。

2 结果

2.1 不同种质间多糖、醇溶性浸出物与农艺性状比较18个柳叶白前种质间多糖、醇溶性浸出物含量、农艺性状均存在极显著差异（P＜0.01）。其中，广东阳山种质株高、茎粗、叶宽、叶长宽积，浙江临安种质叶长，四川峨眉山种质叶长宽比，江苏金坛种质根状茎长、根状茎产量，福建浦城种质根状茎直径，浙江松阳种质根状茎节间长指标最高，分别达到103.66cm、2.41mm、1.18cm、7.09cm2、6.03cm、8.72、7.21cm、3.12 kg/10m2、3.21mm与3.85cm；供试柳叶白前多糖平均含量为6.54%，浙江建德种质多糖含量最高，达8.50%，安徽祁门种质含量最低，仅为3.84%；醇溶性浸出物平均含量为10.16%，浙江临海种质含量最高，达12.85%，江苏溧阳种质最低，仅为8.20%，见表3；相关性分析显示，柳叶白前多糖含量与茎粗、叶长、叶长宽比、根状茎直径、根状茎间节长、产量指标呈显著正相关，与叶宽、根状茎长、海拔相关性较低；浸出物含量与叶长、叶长宽比、根状茎直径与产量指标呈显著正相关，与叶宽、根状茎长呈负相关，与经纬度、海拔相关性较低，见表4。

2.2 主成分分析与优良种质筛选主成分分析显示12个供试性状可简化为5个主性状成分，累计贡献率达91.21%。其中，第1主成分特征根值为5.3250，贡献率为44.37%，株高、茎粗、叶长、叶宽、叶长宽积与产量指标特征向量较大，且为正值，构成本成分主要变异来源；第2主成分特征根值为2.7076，贡献率为22.56%，多糖含量、浸出物含量、叶长宽比为主要变异来源。见表5。以第1主成分Y（i，1）＞0且Y（i，2）＞0为入选标准，筛选出浙江建德、浙江临安、浙江临海与浙江松阳4个优良种质，表现出生长势好，根状茎发达，多糖与浸出物含量高等优良性状。见表6。

表2 加样回收率试验（n=3）

表3 供试柳叶白前农艺性状、多糖与浸出物含量比较（n=15）

表4 多糖、浸出物含量与农艺性状、经纬度、海拔间相关性分析

表5 入选主成分的特征根值、贡献率、累计贡献率与特征向量

表6 入选优良种质的主成分值

2.3 聚类分析按照类平均法，依据D2=7.19的聚类水平，将18个供试柳叶白前种质分为4大类（图1）。第Ⅰ类群共5个种质，以浙江种质为主，分别为浙江建德、浙江松阳、四川峨眉山、浙江临海与浙江上虞，该类群植株较高或中等高度，茎较粗，叶中等大小较狭长，根状茎产量高，多糖与浸出物含量高，筛选的大部分优良种质归在此类；第Ⅱ类群共5个种质，分别为浙江莲都、福建蕉城、江苏金坛、江苏溧阳与广东阳山，该类群植株较高或中等高度，茎较粗，叶片大而宽厚，根状茎产量高，但多糖与浸出物含量较低；第Ⅲ类群共4个种质，分别为浙江临安、江西资溪、福建浦城与安徽休宁，该类群浙江临安种质植株生长势好，根状茎产量于成分指标均表现较好，其余种质植株较矮，茎较细，多数叶片小而狭长，根状茎产量低，多糖与浸出物指标表现一般；第Ⅳ类群共4个种质，分别为江西临川、广西马山、安徽祁门与广西田林种质，该类群植株中等高度或较矮，茎较细，叶片大多小而宽厚，根状茎产量低，多糖与浸出物含量较低。

图1 柳叶白前种质聚类分析图

3 讨论

供试柳叶白前不同种质间农艺性状、多糖与醇溶性浸出物含量存在极显著差异（P＜0.01），表现出较丰富的遗传多样性，可作为良种选育的种质材料；柳叶白前多糖、醇溶性浸出物含量与产地、农艺性状关系密切，与叶长、叶长宽比、根状茎直径与产量呈显著正相关，各产地中浙江、四川种质多糖与醇溶性浸出物含量较高，其次为江西、广东、广西种质；12个供试性状可简化为5个主成分性状，累计贡献率为91.21%，其中第1主成分主要为农艺性状产量指标，以叶长宽比与根状茎产量为主，第2主成分为多糖、浸出物含量指标；18个种质可划分为4个类群，其中类群Ⅰ植株较高，茎较粗，地下部根状茎发达，多糖与浸出物含量高，总体表现较好；柳叶白前良种选育时，可优先在根状茎发达，高叶长宽比的浙江建德、浙江临安、浙江临海与浙江松阳种质中选择。

2015年版《中国药典》对白前药材质量暂无定量标准规定，本试验柳叶白前多糖与醇溶性浸出物含量为6.54%与10.16%，可为后续柳叶白前药材质量标准制订提供参考。中药材产地生态环境包括水、土壤、生物、气候等环境因子，在中药材生长发育过程中各环境因子间相互影响与关联，本试验对不同区域的海拔与柳叶白前多糖、醇溶性浸出物含量进行了初步考察，下一步将在优良种质筛选的基础上，开展同一区域内不同海拔对柳叶白前活性成分积累的影响分析，以减少环境因子间互作关联性的影响。

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（收稿：2016-12-12修回：2017-01-10）

浙江省丽水市人民医院药剂科（丽水323000）

陈健苗，Tel：0578-2780083；E-mail:lstracy1027@163.com