小儿脑性瘫痪与GAD1基因相关性研究分析

魏慧珍，尚 清

(郑州儿童医院，河南 郑州 450000)

小儿脑性瘫痪与GAD1基因相关性研究分析

魏慧珍，尚 清*

(郑州儿童医院，河南 郑州 450000)

目的：分析研究小儿GAD1基因中第2、7、10号外显子突变与小儿脑性瘫痪之间的相关性。方法：对94例脑性瘫痪患儿(研究组)以及同期收治的非神经系统疾病和非脑瘫患儿94例(对照组)进行分子生物学研究，经患儿家长同意后收集所有儿童的外周血，利用试剂盒提取其DNA，并设计引物，采用PCR-SSCP对脑性瘫痪患儿和对照组儿童GAD1基因部分外显子检测。结果：研究组和对照组中所有儿童进行PCR-SSCP检查之后发现，所有儿童GAD1基因中第2、7、10号外显子均未有异常突变，两组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论：GAD1基因中第2、7、10号外显子在小儿脑性瘫痪患者中均不存在突变现象，说明小儿脑性瘫痪与其GAD1中第2、7、10号外显子之间可能无相关性，但是并不排除与其他外显子之间存在相关性。

小儿脑性瘫痪；GAD1基因；外显子

小儿脑瘫主要是由于患儿在出生前或者出生后1个月内受到各种综合因素的影响，进而影响患儿大脑发育或者出现脑损伤等情况，出现一系列的运动性障碍综合征[1]。脑性瘫痪患儿的临床特点为姿势异常、中枢性运动障碍，同时伴随有智力、认知能力、听力、语言功能、感觉功能障碍等情况[2]。该病在临床上具有较高的病死率，随着近年来医学技术水平的发展，脑性瘫痪患儿临床死亡率有所下降，但是脑瘫患儿中高危患儿的存活率提高，进而使得该病在临床上的发病率逐年增长[3]。因此，研究脑性瘫痪的病因是目前临床研究的重点话题。大量文献研究表明，脑性瘫痪患儿的发病与遗传易感性之间关系密切，存在家族遗传史的脑性瘫痪患儿的发病率较高[4]。本文对94例脑性瘫痪患儿以及同期收治的非神经系统疾病和非脑瘫患儿94例进行分子生物学研究，探讨脑性瘫痪患儿的发病与其GAD1基因之间的相关性，现对具体内容分析报告如下。

1 资料及方法

1.1 一般资料

本文研究对象是郑州儿童医院2015年11月～2016年11月收治的94例脑性瘫痪患儿以及同期收治的非神经系统疾病和非脑瘫患儿94例。其中94例脑性瘫痪患儿为研究组，94例非脑瘫患儿为对照组。研究组中患儿男女比例49：45；患儿年龄1个月～3岁，平均(1.82±0.78)岁；其中79例患儿为痉挛型，15例患儿为不随意运动型。对照组中男女患儿比例为46：48；患儿年龄2个月～4岁，平均(1.93±0.89)岁。两组患儿男女构成比例以及年龄相比无差异(P>0.05)。所有患儿家属均自愿签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器

DNA提取试剂盒(广州东生生物有限公司生产)；Taq DNA聚合酶(大连宝生物有限公司)；所用其他试剂纯度为分析纯。Thermo fisher Scientifile-905低温冰箱(美国Thermo公司)； JY 600C 型电泳仪、JY-SPCT 型水平电泳槽和JY-SQ6 型垂直电泳槽(北京君意东方公司生产)； GIS型凝胶图像处理系统(上海天能公司生产)； 7300 型荧光定量PCR 仪(美国ABI 公司)。

1.3 方法

采集两组患儿静脉血2mL，置于经过EDTA抗凝处理的试管中，标记并保存于-80℃，采用DNA提取试剂盒对所有患儿血液中基因组DNA进行提取，之后进行定量分析和纯度分析。分析之后进行PCR扩增GAD1基因中第2、7、10号外显子，外显子引物序列交由北京英俊公司合成，具体见表1。

表1 GAD1基因进行PCR扩增中引物序列、扩增片段长度和退火温度

PCR扩增过程中体系为50 uL，0.25 uLTaq酶，5 uL10×Buffer，4 μL dNTP，1 μL DNA，正向引物、反向引物各1 μL，37.75 μL双蒸水，利用涡旋仪充分混匀后放入PCR 仪中。PCR 反应条件：预变性温度94℃，时间5 min；变性温度94℃，时间30 s，退火温度55℃、56℃，时间30 s，延伸温度72℃，时间60 s，共进行35 个循环；最后72℃延伸10 min。PCR 产物电泳时间约30 min，利用凝胶成像系统对结果进行观察。SSCP：制备6%聚丙烯酰胺凝胶60 mL，用于配胶。迅速将PCR产物在98℃变性10 min后转移至冰浴中进行上样，电泳条件：温度为4℃，300 V电泳5 min，120 V电泳13 h。最后进行固定、染色与显色，利用凝胶成像系统对结果进行观察。经上述分析后对怀疑有外显子突变的样本PCR产物进行送样纯化分析。

1.4 统计学方法

2 结果

研究组和对照组共188例患儿血样进行PCR-SSCP筛查, 结果发现，研究组中有1例患儿血液样本中GAD1中第2外显子在SSPC电泳结果中出现异常条带(见图1中箭头所示)，其他外显子和对照组中所有外显子均未有异常条带出现。对出现异常的条带进行送样纯化分析，结果显示未有突变情况。

图1 研究组GAD1第2外显子SSCP图

图2 对照组GAD1第2外显子SSPC图

3 讨论

GAD(谷氨酸脱羧酶)的作用主要是通过将氨基酸与兴奋性的神经递质谷氨酸盐形成抑制性的神经递质γ氨基丁酸的主要限速酶[5]。GAD的主要结构为磷酸吡哆醛(PLP)和脱辅基酶蛋白，其中PLP为辅基，是GAD发挥活性的关键。GAD酶活性的调节主要是通过GAD控制体内PLP以及脱辅基酶蛋白通过聚合和解离进行调节[6]。GAD水平高低和活性在一定程度上决定了机体内谷氨酸和γ氨基丁酸的浓度。近年来，大量的研究表明GAD与多种神经系统疾病的发生有关，常见的疾病包括精神分裂症、癫痫等。另外有文献表明GAD与糖尿病的发生也有密切关系[7]。

本次研究对GAD1基因外显子进行研究分析，通过PCR扩增技术对GAD1基因第2、7、10外显子进行扩增，并进行SSCP分析，结果表明，研究组中有1例患儿第2外显子发生异常，但是经过提纯分析发现未有突变情况，而对照组检测结果显示未有任何突变发生。 这一结果与Lynex等的研究结果存在差异，文献中报道，脑瘫患儿的GAD1基因有突变情况，而本次研究中并未有突变。这一结果的原因可能患者的种族差异相关。同时也有可能受到样本数量的影响，具体情况有待于进一步研究。

综上所述，小儿脑性瘫痪与GAD1基因中第2、7、10号外显子突变无相关性，但是这一结果并不表示小儿脑性瘫痪与其他外显子突变无相关性，本文的研究只是初步验证，有关小儿脑性瘫痪与基因以及突变位点的研究有待于进一步深入。

[1] 张 丽. 引导式教育在小儿脑瘫康复中的作用[J]. 中国康复理论与实践，2012, 18(4): 362-364.

[2] 汤明丽，吕复莉，唐久来. 小儿神经康复中心小儿脑瘫康复治疗的现状及进展[J]. 安徽医学，2012, 33(9): 1255-1257.

[3] 陈国新，苏 衡. 小儿脑瘫患者合并肺部感染的临床特点[J]. 广东医学，2012, 33(16): 2440-2441.

[4] 张晓杰，郭继东，伊洪波. 小儿脑瘫患者的危险因素分析[J]. 中国妇幼保健，2012, 27(29): 4549-4551.

[5] 高志平，贾 宁. 小儿脑瘫病因学研究进展[J]. 中国妇幼保健，2012, 27(1): 149-150.

[6] 李红丽. 小儿脑瘫45例的家庭综合康复训练效果分析[J]. 中国儿童保健杂志，2012, 20(6): 555-558.

[7] 邹小英，石 坚，方素珍，等. 多种定位方式下A型肉毒毒素肌肉注射治疗小儿脑瘫肌痉挛的疗效[J]. 广东医学，2013, 34(6): 882-884.

本文编辑：王 霞

郑州市科学技术局科研项目(20140508)

魏慧珍，女，医师，从事神经电生理及癫痫，神经免疫性疾病临床工作

尚 清，女，主任医师，教授，E-mail:578623597@qq.com

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