高良姜中4种黄酮化合物的体外抗氧化能力及抑菌活性研究

汪光华

唐树平2

彭名军3

马广智1

吴佩君1

杨 喆1

王静辉1

黄儒强1

(1. 华南师范大学生命科学学院，广东 广州 510631；2. 上海玖旭化妆品有限公司，上海 201613；3. 广州市食品检验所，广东 广州 510410)

高良姜中4种黄酮化合物的体外抗氧化能力及抑菌活性研究

汪光华1

唐树平2

彭名军3

马广智1

吴佩君1

杨 喆1

王静辉1

黄儒强1

(1. 华南师范大学生命科学学院，广东 广州 510631；2. 上海玖旭化妆品有限公司，上海 201613；3. 广州市食品检验所，广东 广州 510410)

从高良姜中提取纯化得到高良姜素、山奈素、山奈酚和槲皮素，以该4种黄酮化合物为原料，对比分析其抗氧化活性，及其对6种食源性腐败菌的抑制作用。结果表明，在抗氧化方面，槲皮素表现出较好的抗氧化活性，山奈酚和山奈素次之，高良姜素最低，但高良姜素在ABTS自由基清除试验中活性与山奈酚和山奈素相似。在抑菌方面，金黄色葡萄球菌对4种黄酮化合物较为敏感，其中枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌对槲皮素较为敏感(MIC值分别为1.25，2.50 mg/mL，MBC值均为2.5 mg/mL)；大肠杆菌、白色念珠菌、黑曲霉和绿脓杆菌对4种化合物敏感性低，抑菌活性均不明显。

高良姜；黄酮；抗氧化；抑菌活性；构效关系

高良姜(Rhizoma Alpinia officinarum)为姜科山姜属(Alpinia)植物高良姜的干燥根茎(Alpinia officinarum Hance)，别名：高凉姜、良姜、佛手根，主要分布于海南、广东、广西和云南，是著名的十大南药之一。高良姜是卫生部认定的药食同源药材之一，作为常用天然调味香料也被大量用作食品调味料、咖喱粉、卷烟加香等。从高良姜中提取的精油，其主要成分为高良姜素，可用于制造驱风油、万金油、高级香水、香皂、食用调料等[1]。高良姜含有多种活性成分，其中主要的活性物质为：高良姜素、山奈素、山奈酚和槲皮素等化合物(图1)[2]。

许多来自植物中的黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性和抑菌作用[3-6]。高良姜活性成分的抗氧化和抑菌等作用已被大量研究，其已知主要化合物高良姜素、山奈素、山奈酚和槲皮素皆为黄酮醇化合物，结构相似，均是母核结构为2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)的多酚类化合物[7]427-430。当前也有涉及这些化合物的相关药理活性研究[8-10]，但针对某一植物的主要化合物的活性分析，去间接评价该植物的生理药理活性的研究相对较少。

图1 高良姜中4种黄酮化合物的结构示意图Figure 1 Chemical structure of Galangin, Kaempferide, Kaempferol, Quercetin

目前，关于高良姜中主要化合物活性之间的相关研究存在针对性、综合性不强的问题，这些研究只是单纯地采用某一两种分析方法对高良姜化合物进行活性评价，或简单地对高良姜中化合物进行研究，并没有针对哪一类化合物、其含量主次、结构性质等方面进行研究，达到间接评价高良姜的应用能力的目的[7]515-516[11-13]。因此，本试验针对从高良姜中分离纯化的主要活性化合物(高良姜素、山奈素、山奈酚和槲皮素4种化合物)的抗氧化活性和对常见的几种食源性腐败菌的抑制作用进行研究，采用5种不同的分析方法综合研究高良姜中4种化合物的体外抗氧化活性。同时初步分析不同的评价方法及化合物结构，对各化合物活性存在的影响；通过对高良姜中4种化合物对6种常见食源性腐败菌(包括细菌、真菌)的抑制作用进行研究，间接评价高良姜防腐保鲜的应用价值。通过上述研究，以期为高良姜在食品、化妆品、保健品以及药品等领域的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与主要试剂

高良姜素、山奈素、山奈酚和槲皮素：纯度98.0%以上，本实验室从高良姜中提取纯化所得；

1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)：纯度96%，美国Sigma-Aldrich GmbH公司；

菲啰嗪：纯度97%，美国Sigma-Aldrich GmbH公司；

乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：纯度98%，美国Sigma-Aldrich GmbH公司；

亚油酸：纯度99%，美国Sigma-Aldrich GmbH公司；

FeCl3、FeCl2：痕量金属总含量<0.01%，美国Sigma-Aldrich GmbH公司；

甲醇、二甲基亚砜(DMSO)：色谱纯，麦克林公司；

其他所有试剂均为分析纯；

刃天青(7 -羟基- 3 -羰基- 10 -氧化-三氢吩恶嗪钠盐)：90%，美国Sigma-Aldrich GmbH公司；

灭菌96孔板：costar 3599，美国Corning公司；

营养肉汤 、琼脂粉、麦芽汁：广东环凯微生物科技有限公司；

金黄色葡萄球菌Staphyloccocusaureus(ATCC 6538)、大肠杆菌Escherichiacoli(ATCC8739)、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(ATCC6633)、绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa(ATCC27853)、白色念珠菌Canidiaalbicans(ATCC 10231)、黑曲霉Aspergillusniger(ATCC 16404)：广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2 仪器与设备

紫外分光光度仪：Shimadzu UV-2450/2550型，日本岛津公司；

电子分析天平：TE124S型，德国Sartorius公司；

双人单面净化工作台：SW-CJ-2FD型，苏州净化设备有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS-50S11型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

电热恒温振荡水浴锅：DKZ-2型，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 抗氧化活性测定

1.2.1 DPPH自由基清除能力 根据文献[14]，修改如下：移取各化合物甲醇标准溶液(0.003～1.000 mg/mL)0.1 mL加入到含有3.9 mL新配制的DPPH甲醇溶液(57.65 μmol/L)试管中，立即将其放入紫外分光光度计中进行检测，直至吸光值稳定；取DPPH浓度梯度(1.78～57.65 mmol/L)按上述方法得其线性回归方程。反应液中DPPH浓度(XDPPH)通过线性回归方程得到，其DPPH清除率由式(1)计算：

(1)

式中：

S——DPPH自由基清除率，%；

AT——反应稳定时，反应液吸光度；

A0——反应开始瞬间，反应液吸光度。

1.2.2 总抗氧化活性测定(FTC法) 根据文献[15]，修改如下：取2.5 mL 各样品DMSO溶液加入2.5 mL亚油酸乳浊液中，其中2.5 mL亚油酸乳浊液由磷酸钾缓冲液(0.04 mol/L，pH 7.0)、8.75 μg吐温-20和7.75 μL亚油酸组成，反应液37 ℃水浴；对照组由2.5 mL亚油酸乳浊液和2.5 mL DMSO溶液组成。在水浴过程中，每隔5 h取出反应液0.1 mL，加入FeCl20.1 mL(20 mmol/L)反应10 min，再加入0.1 mL硫氰酸铵(30%)后在500 nm处检测其吸光度，当对照组达到最高吸光值时，停止检测。脂质过氧化抑制率按式(2)计算：

(2)

式中：

C——脂质过氧化抑制率，%；

A0——空白对照组吸光度；

A1——试验组吸光度。

1.2.3 总还原能力的测定 根据文献[16]，修改如下：在1 mL不同浓度的样品甲醇溶液(7.5～500.0 μg/mL)中加入磷酸钾缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1%的K3Fe(CN)6溶液各2.5 mL，反应液50 ℃水浴20 min。在反应液中加入三氯乙酸水溶液(2.5 mL，10%)，离心(10 min，1 000 r/min)。取2.5 mL上清液、0.5 mL FeCl3(0.1 g/100 mL)和2.5 mL甲醇混合，在700 nm处测定吸光值。吸光值越大表示还原能力越强。

1.2.4 ABTS自由基阳离子清除能力测定 根据文献[17]，修改如下：将ABTS+•溶液(7 mmol/L，10 mL)和过硫酸钾(2.45 mmol/L，10 mL)混合反应，储存于室温黑暗处12 h。使用之前，ABTS•+溶液用磷酸钾缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4)稀释，使之在734 nm处吸光值为0.700±0.025备用。然后取1 mL ABTS•+溶液添加到3 mL不同浓度样品甲醇溶液中，室温反应30 min，在734 nm处测其吸光度；取备用ABTS•+溶液0.031 25～1.000 00 mL配成1 mL各梯度浓度溶液，按上述方法得其线性回归方程。通过线性回归方程得到反应液中ABTS•+的浓度[ABTS·+]，按式(3)计算样品的ABTS•+清除能力：

(3)

式中：

R——ABTS•+清除率，%；

AControl——ABTS•+起始浓度时的吸光值；

ASample——样品存在时的吸光值。

1.2.5 金属离子清除能力测定 根据文献[18]，修改如下：取样品0.5 mL加入0.1 mL FeCl3(0.1 mol/L)，30 min后，添加0.1 mL菲啰嗪(1 mmol/L)，最后加入甲醇至总体积为4 mL。将反应液置于562 nm处检测。

1.3 抑菌活性测定

1.3.1 菌种的活化 按文献[19]方法活化各保藏菌种，放进冰箱备用。

配置马铃薯葡萄糖琼胶(PDA)培养基(黑曲霉)、麦芽汁培养基(白色念珠菌)和牛肉膏培养基(细菌)。按照文献[20]配置各种菌液，并将4种细菌和2种真菌制成浓度约为108CFU/mL和 106CFU/mL的菌悬液。

1.3.2 抑菌活性测定 据文献[21]所述平板琼脂打孔法测定各化合物对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性，以DMSO溶液作为空白对照。每组做3个平行，算出抑菌圈直径平均值。

据文献[22]所述方法测定各化合物对黑曲霉的抑制活性，以DMSO溶液作为空白对照。每组做3个平行，算出抑菌圈直径平均值。

上述试验操作均遵守无菌操作规程。

1.3.3 最低抑菌浓度(MIC值)的测定 采用刃天青显色法[23]。

1.3.4 最低杀菌浓度(MBC)的测定 采用平板画线法[24]，在MIC值的基础上测定各化合物的最低杀菌浓度(MBC)。

1.4 数据处理与分析

利用Originpro 8.0软件对试验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性测定

2.1.1 DPPH自由基清除能力 高良姜素、山奈素、山奈酚及槲皮素的抗氧化活性见图2。各化合物的DPPH自由基清除能力由式(1)和(4)求得。由图2可知，槲皮素的DPPH自由基清除能力最强，其他依次是山奈酚、山奈素、高良姜素。可能与4种化合物所含的活泼氢数量密切相关，活泼氢数量越多其抗氧化活性越强[25]。

A517=0.020 74×XDPPH+0.003 83(r2=0.999 57)。

(4)

图2 各黄酮化合物的DPPH自由基清除能力

Figure 2 DPPH radical scavenging potential of different concentrations of Galangin, Kaempferide, Kaempferol, Quercetin

2.1.2 脂质过氧化抑制试验(FTC法) 由图3可知，槲皮素具有较强的抗脂质过氧化活性，4种化合物之间的脂质过氧化抑制活性大小为：槲皮素>山奈酚>高良姜素≈山奈素。一般来说，黄酮类化合物所含活泼氢的数量越多其抗脂质过氧化能力越强，但是结果中高良姜素(B环无羟基)与山奈素(-O-)的活性相似，可能与山奈素B环结构尚无法增强其活性，也可能与测试方法的原理、适用条件等因素有关[26]。

2.1.3 总还原能力的测定 由图4可知，4种化合物都表现出高效的还原能力，其还原能力随吸光度的增加而增加，表明其还原能力随着质量浓度的增加而不断提高，具有量效关系。其中槲皮素的还原能力最强，因其黄酮结构B环中含有2个相邻的活泼羟基，可能与羟基氧原子的p-π共轭效应有强烈的斥电子作用，使与活性自由基反应生成的黄酮自由基更加稳定，生成的自由基越稳定。其他3种化合物的还原能力大小顺序：山奈酚>山奈素>高良姜素。可能与4种化合物所含活泼氢密切相关，活泼氢数量越多其抗氧化活性越强。

各试验组1#用量为0.125 mg，2#用量为0.062 5 mg图3 各黄酮化合物对脂质过氧化的影响

Figure 3 The effects of various concentrations of GalanginKaempferide on peroxidation of linoleic acid emulsion

图4 不同浓度黄酮化合物的总还原能力Figure 4 Total reductive potential of different concentrations of Galangin

2.1.4 ABTS阳离子自由基清除能力测定 图5显示，各化合物的ABTS•+清除活性随其浓度的增大而升高，其中槲皮素自由基清除活性相较另外3种化合物表现得很强，在浓度为0.4 μg/mL时,ABTS•+清除能力升高的较为显著，其他3种化合物的ABTS•+清除能力相似，可能是槲皮素结构中B环含有2个活泼羟基，另外3个化合物活泼羟基数量有限；该测试方法适用条件不同、敏感性不足，或与测试方法适用范围、原理有关，不能有效评价该3种化合物ABTS自由基清除能力。

A=0.158 09×[ABTS·+]-0.004 04(R2=0.999 9)。

(5)

2.1.5 金属离子清除能力测定 由图6可知，4种化合物的金属离子清除能力与其浓度具有量效关系，随其浓度的增加升高(15～500 μg/mL)，各化合物金属离子清除能力的顺序为：槲皮素>山奈酚>山奈素>高良姜素。与4种化合物所含活泼氢密切相关，活泼氢数量越多其抗氧化活性越强。

2.2 化合物的抑菌活性

2.2.1 化合物的抑菌作用 由表1可知，在抑制细菌方面，浓度均为10 mg/mL的4种黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌都具有一定的抑制效果，它们的抑菌能力依次是槲皮素>高良姜素>山奈素>山奈酚；大肠杆菌敏感性低，4种化合物对其抑制作用不明显；槲皮素对枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用(抑菌圈16.59 mm)，另外3种化合物抑菌效果不明显；几种化合物对绿脓杆菌抑制效果不明显。

图5 不同浓度黄酮化合物的ABTS•+清除能力Figure 5 ABTS radical scavenging of different concentrations of Galangin, Kaempferide, Kaempferol, Quercetin

图6 不同浓度黄酮化合物的金属离子清除能力Figure 6 Metal ionscavenging of different concentrations of Galangin, Kaempferide, Kaempferol, Quercetin

在真菌方面，高良姜素对黑曲霉具有一定的抑制效果，抑菌圈为8.16 mm，抑菌作用较弱，其他3种化合物抑菌效果不明显；高良姜素、槲皮素对白色念珠菌具有抑制效果。

2.2.2 化合物的最低抑菌浓度(MIC值)和最低杀菌浓度(MBC值) 在96孔板中采用二倍稀释法和平板划线法分别测定了4种黄酮化合物对供试菌的MIC值和MBC值，结果见表2。由表2可知，4种黄铜化合物对各菌种的抑制和杀菌能力各不相同。在抑制真菌方面，各黄酮化合物对黑曲霉的抑制效果较佳，槲皮素展现了一定的抑制效果，其MIC值与MBC值均为1.25 mg/mL；同时在白色念珠菌中，高良姜素(MIC值与MBC值分别为1.25，2.50 mg/mL)表现出了一定的抑制作用。在对细菌的抑制研究中，以金黄色葡萄球菌的敏感性最强，各黄酮化合物对其均有较好的抑制活性，其中高良姜素和槲皮素的(MIC值与MBC值分别为1.25，2.50 mg/mL)较好；对枯草芽孢杆菌抑制作用中，各化合物的抑制作用一般；绿脓杆菌和大肠杆菌的敏感性较弱，各化合物的MIC值与MBC值较高，抑制活性均较弱。该结果与抑菌圈直径的结果基本一致。

表1 高良姜4种黄酮化合物对6种普通食源性腐败菌的抑制作用Table 1 Inhibition zone diameters of four flavonol compounds from Alpinia officinarum Hance rhizome against 6 common foodborne pathogenic

表2 高良姜中4种黄酮化合物对6种普通食食源性腐败菌的MIC值和MBC值Table 2 The MIC and MBC of four flavonol compounds from Alpinia officinarum Hance rhizome against 6 common foodborne pathogenic mg/mL

3 结论

本试验从抗氧化和抑菌作用两方面，测定高良姜提取物中4种主要化合物的相关活性，对比分析其抗氧化活性和对6种食源性腐败菌的抑制作用。分析表明：

(1) 4种化合物的抗氧化能力大小顺序具有一定的规律性和构效关系，其中槲皮素在各评价方法中均表现出较好的抗氧化活性；各种分析方法对各化合物活性的测定结果也存在一定的影响。

(2) 不同化合物对菌种的抑制作用具有选择性和差异性，其中4种黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌抑制作用较为高敏；槲皮素对枯草芽孢杆菌的抑制作用较为敏感。

综合分析各化合物相关活性，为以后高良姜相关活性部位的筛选及其应用研究提供参考。此外，由于本试验的局限性，后续试验可对高良姜主要活性物质抗癌、体内抗氧化、抗血脂、抗衰老作用及其相关作用机制进行研究。

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Study on the antioxidant and antimicrobial activities of four flavonol compounds fromAlpiniaofficinarumHance rhizomein vitro

WANGGuang-hua1

TANGShu-ping2

PENGMing-jun3

MAGuang-zhi1

WUPei-jun1

YANGZhe1

WANGJing-hua1

HANGRu-qiang1

(1.CollegeofLifeScience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou,Guangdong510631,China;2.ShanghaiJoiesCosmeticsCo.,Ltd,Shanghai201613,China;3.GuangzhouInstituteforFoodControl,Guangzhou,Guangdong510410,China)

The in vitro antioxidant and the antimicrobial activities of four flavonol compounds (Galangin, Kaempferide, Kaempferol and Quercetin) extracted and separated ofAlpiniaofficinarumHancerhizomein were studied. The results showed that quercetin had most significant antioxidant activity among the four flavonoids. Moreover, the antioxidant activity of the other three flavonol compounds in order, Kaempferol (highest), Kaempferide, Galangin (lowest). However the ABTS radical scavenging experiment results showed that the antioxidant activities of the three compounds were the same. The further antimicrobial experiment results showed that four flavonol compounds had antimicrobial activity toStaphylococcusaureus.S.aureusandBacillussubtiliswere two of the most sensitive among all the test strains to quercetin, and the MIC and MBC were detected to be 1.25 and 2.5 mg/mL, and 2.5 and 2.5 mg/mL respectively. However, all the four compounds showed very weak resistance againstEscherichiacoli,P.aeruginosa,AspergillusnigerandMoniliaalbican.

Galangin; Flavonol; Antioxidant activity; Correlation between the structure and activity; antimicrobial activity

华南师范大学研究生创新基金项目(编号：2015lkxm24)；广州市产学研协同创新重大专项(编号：201604020068)；广州市科技计划项目(编号：201707010372)；广东省林业科技创新项目(编号：2016KJCX008)

汪光华，男，华南师范大学在读硕士研究生。

黄儒强(1968—)，男，华南师范大学教授级高级工程师，博士。E-mail：qiangdoctor@126.com

2017—01—09

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.034