Box-Behnken响应面分析法优化桦褐孔菌多糖提取工艺

蔡 丽，陈忠敏，王富平，袁 森，阮廷飞

(重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054)



Box-Behnken响应面分析法优化桦褐孔菌多糖提取工艺

蔡 丽，陈忠敏，王富平，袁 森，阮廷飞

(重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054)

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素实验基础上，研究料液比、提取温度、提取时间、酶解时间及其交互作用对多糖得率的影响。结果表明：桦褐孔菌多糖的最优提取工艺为：料液比1∶30，提取温度90 ℃，提取时间5 h，酶解时间65 min，多糖得率理论值为3.598%，实际测得多糖得率为(3.575±0.24)%。Box-Behnken实验设计方法可较好地对桦褐孔菌多糖的提取工艺进行优化，在该工艺下提取得到的桦褐孔菌多糖质量稳定。

桦褐孔菌；多糖；Box-Behnken响应面分析法

桦褐孔菌，学名Fuscoporiaobliqua(Pers:Fr.) Aoshi或Inonotusobliquus(Fr.) Pilat，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、褐卧孔菌属[1]，是一种含有多种活性物质的药用真菌，东欧及亚洲很多国家将其用于糖尿病、癌症、免疫系统疾病的预防等[2-3]。自1977年Lobarzewski[4]首次从桦褐孔菌中分离出血红素蛋白酶以来，各国学者相继对桦褐孔菌的化学成分进行了研究开发，Zheng等[5]对分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水萃取的桦褐孔菌产物类型进行了分析，明确了不同溶剂中的提取物成分，Song等[6]发现桦褐孔菌发挥抗癌效果的主要成分是多糖。

本研究以采自中国大兴安岭的桦褐孔菌为原料，在单因素实验的基础上通过响应面法优化提取温度、提取时间、料液比、酶解时间对桦褐孔菌多糖得率的影响，旨在为桦褐孔菌多糖(IOPS)资源的合理利用提供一定的实验基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AE240 METTLER 电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，TU-1901双光束紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司)，旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州科丰仪器设备有限公司)，真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 材料

桦褐孔菌采自大兴安岭，经陈忠敏教授鉴定为桦褐孔菌Inonotus obliquus的子实体；纤维素酶、苯酚、浓硫酸、无水乙醇均购自成都市科龙化工试剂厂。

2 方法与结果

2.1 纤维素酶辅助提取桦褐孔菌多糖工艺

桦褐孔菌经机械粉碎后，用20倍体积的浓度为85%的乙醇在70 ℃条件下回流两次，每次3 h，过滤，去除上清，取滤渣于60 ℃真空干燥箱中干燥12 h挥干溶剂后即得预处理桦褐孔菌粉，分装备用。取预处理的桦褐孔菌粉，加入pH值为5.0的醋酸—醋酸钠缓冲液中,参考文献[7]加入桦褐孔菌重量3%的纤维素酶于50 ℃条件下酶解一段时间后，迅速升温至提取温度进行提取，过滤收集滤液，浓缩，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇，4 ℃静置过夜，离心收集沉淀，60 ℃真空干燥至恒重，即得桦褐孔菌粗多糖。

2.2 苯酚-硫酸法测桦褐孔菌多糖方法学的建立

1) 标准品溶液的制备

精密称定105 ℃真空干燥至恒重的葡萄糖标准品100 mg，去离子水定容至100 mL，摇匀，得浓度为1.0 mg/mL的葡萄糖标准储备液。吸取葡萄糖标准储备液10 mL，用去离子水定容至100 mL，得浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准工作液。

2) 供试品溶液的制备

精密称取50 ℃干燥至衡重的桦褐孔菌粗多糖100 mg，用去离子水溶解并定容至100 mL，再精密量取20 mL用去离子水稀释定容至100 mL作为供试品溶液。

3) 苯酚溶液的配制

精密量取苯酚溶液5 mL，置100 mL容量瓶中，加去离子水定容至刻度，摇匀即可。

4) 检测波长的确定

取葡萄糖标准工作液 5 mL于10 mL容量瓶中，去离子水定容，取2 mL，立即加入5%苯酚溶液2 mL，浓硫酸10 mL，混匀，室温放置30 min，待其冷却后用紫外可见分光光度计在波长200～800 nm 范围内扫描，485 nm处有最大吸收峰，故选择485 nm为检测波长。

5) 标准曲线的绘制

精密吸取葡萄糖标准工作液2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mL，去离子水定容至10 mL，得系列浓度为25、30、35、40、45、50、55、 60 μg/mL 的葡萄糖标准品溶液。分别吸取2 mL，立即加入5%苯酚溶液2 mL，浓硫酸10 mL，混匀，室温放置30 min，待其冷却后用紫外可见分光光度计在485 nm处测吸光度，得葡萄糖浓度—吸光度标准曲线：y=-0.074 51+0.007 75x，R2=0.999，表明对照品浓度在25.00～60.00 mg/L范围内有良好的线性关系。

6) 精密度实验

精密量取25 mL标准品溶液，去离子水稀释定容至50 mL，按“2.2.5”方法操作，分别连续测定6次吸光度，结果RSD为0.57%，表明本方法选用实验仪器精密度良好。

7) 稳定性实验

精密吸取供试品溶液2 mL，按标准曲线的绘制方法操作，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h测定吸光度，结果RSD为1.81%，表明桦褐孔菌粗多糖显色后在3 h内稳定性良好。

8) 重复性实验

精密称定6份标准品溶液、50 ℃真空干燥至衡重的桦褐孔菌多糖5 mg，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，按标准曲线的绘制方法测定样品溶液的吸光度，结果RSD为1.13%，表明本方法的重复性良好。

9) 加样回收率实验

分别精密量取适量供试品溶液6份，根据供试品溶液减半后总多糖的含量，加入含有等量无水葡萄糖的标准品溶液，按标准曲线的绘制方法进行含量测定，计算回收率，结果见表1。结果表明：桦褐孔菌多糖的平均回收率为98.85%，RSD=1.36%(n=6)，均符合要求。

10) 多糖得率的计算

桦褐孔菌水提取物得率(%)=提取物干重(g)/桦褐孔菌粉质量(g)×100%

桦褐孔菌多糖纯度(%)=测得的多糖的质量(g)/桦褐孔菌提取物的量(g)×100%

桦褐孔菌多糖得率(%)=桦褐孔菌水提取物得率(%)×桦褐孔菌多糖纯度(%)

2.3 单因素实验

称取已预处理的桦褐孔菌粉，每份6.00 g，分别考察料液比、提取温度、提取时间、酶解时间、提取次数5个单因素对桦褐孔菌多糖得率的影响。

表1 桦褐孔菌多糖加样回收率试验结果

2.3.1 料液比对桦褐孔菌多糖提取率的影响

精密称定6.00 g已预处理的桦褐孔菌粉，以料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60分别加入pH值5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液,再加入桦褐孔菌重量3%的纤维素酶,50 ℃酶解60 min，迅速升温至95 ℃，提取5 h，考察多糖得率。结果显示：在料液比为1∶10～1∶30之间时，随着提取液量的增加，多糖得率逐渐增大；在料液比为1∶30～1∶50时，随着提取液量的增大，多糖得率逐渐降低(图1)。这是因为原料一定时，提取液用量过大会导致提取物种类更丰富，从而影响多糖的溶出和醇沉浓度。因此，本实验选取1∶30为最佳料液比。

2.3.2 提取温度对桦褐孔菌多糖提取率的影响

精密称定6.00 g已预处理的桦褐孔菌粉，以料液比1∶30加入pH=5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液,再加入桦褐孔菌重量3%的纤维素酶,50 ℃酶解60 min，分别在提取温度65、75、85、95、100 ℃条件下提取5 h，考察多糖得率。结果如图2，随着提取温度的升高，多糖得率逐渐变大，达峰值后继续升温会使多糖得率略有下降，可能是因为温度过高会导致部分热不稳定性多糖分解，因此选择(90～95) ℃为最佳提取温度。

2.3.3 提取时间对桦褐孔菌多糖提取率的影响

精密称定6.00 g已预处理的桦褐孔菌粉，以料液比1∶30加入pH值5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液,再加入桦褐孔菌重量3%的纤维素酶,在50 ℃下酶解60 min，提取温度为95 ℃时，考察分别提取2，3，4，5，6 h时的多糖得率。结果如图3，多糖得率在提取时间2～5 h内随时间的增加显著升高，此后增加提取时间多糖得率略有下降，这可能与提取时间过长会增加提取液黏度、不利于多糖的溶出有关。考虑到成本与产率因素，提取时间选择5 h为宜。

2.3.4 酶解时间对桦褐孔菌多糖提取率的影响

精密称定6.00 g已预处理的桦褐孔菌粉，以料液比1∶30加入pH值5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液,再加入桦褐孔菌重量3%的纤维素酶,分别在50 ℃下酶解30、45、60、75、90 min，迅速升温至95 ℃，提取5 h，分析酶解时间对多糖得率的影响。图4结果表明：随着酶解时间的延长，多糖得率呈先显著升高再缓慢下降的趋势，说明酶解时间过长可能会使部分多糖碳环裂解，从而降低多糖得率。因此，本实验选择60 min为最佳酶解时间。

2.3.5 提取次数对桦褐孔菌多糖提取率的影响

精密称定6.00 g已预处理的桦褐孔菌粉，以料液比1∶30加入pH值5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液,再加入桦褐孔菌重量3%的纤维素酶,分别在50 ℃下酶解60 min，迅速升温至95 ℃，提取5 h，分别提取1、2、3、4、5次，考察提取次数对多糖得率的影响。结果如图5所示，多次提取并不会显著提高多糖得率，考虑到提取工艺的简便性和经济性，本实验提取次数确定为1次。

图1 料液比对多糖得率的影响

图2 提取时间对多糖得率的影响

图3 提取温度对多糖得率的影响

图4 酶解时间对多糖得率的影响

图5 提取次数对多糖得率的影响

2.4 响应面法优化桦褐孔菌多糖提取工艺

2.4.1 实验设计与结果

根据Box-Behnken实验设计原理，综合单因素实验结果，固定提取次数1次的情况下优选出4个主要影响因素：料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、酶解时间(D)，设计4因素3水平(共29个试验点，5个中心点)响应面试验方案。因素及水平见表2，试验安排与结果见表3。

表2 因素与水平

2.4.2 模型拟合

利用Design-Expert 7.1.6软件对所得数据进行多项式拟合回归，得桦褐孔菌多糖得率(Y)与4个试验因素之间的模拟方程：

Y=3.54-0.013A+0.14B+0.19C+ 0.15D-0.15AB+0.017AC+0.14AD+ 0.065BC-0.018BD+0.12CD- 0.25A2-0.41B2-0.47C2-0.29D2

对该回归方程进行方差分析，结果见表4。该回归模型F值小于0.01，模型决定系数R2=0.979 6，C.V.=2.43，说明回归方程拟合相对显著。失拟项F值1.06，失拟项P=0.5206>0.05，失拟项不显著，说明模型拟合良好，实验误差较小，实验操作性可信。提取温度、提取时间、酶解时间对多糖得率的影响均达到极显著水平(P<0.01)，料液比对多糖得率的影响不显著。影响桦褐孔菌多糖得率的各因素按主次排序为：提取温度>酶解时间>提取时间>料液比。

2.4.3 响应面分析

由方差分析结果可知：料液比/提取温度、料液比/酶解时间和提取时间/酶解时间的交互作用对多糖得率有显著影响。绘制可直观反映各因素交互作用对桦褐孔菌多糖得率影响的响应面分析图，见图6。

表3 Box-Behnken试验设计方案与结果

2.4.4 验证实验

用该模型预测桦褐孔菌多糖提取的最佳工艺条件为：料液比1∶30.05，提取温度91.83 ℃，提取时间4.94 h，酶解时间64.51 min，此条件下多糖得率理论值为3.598%。综合考虑实验操作以及各方面客观因素，修正桦褐孔菌多糖最佳提取工艺为：料液比1∶30，提取温度90 ℃，提取时间5 h，酶解时间65 min。在此条件下进行3次平行验证试验，测得多糖得率为(3.575±0.24)%，与理论值接近，验证了上述响应面法优化得到的提取工艺的准确性。

表4 桦褐孔菌多糖回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验

注：*P<0.05，差异显著；**P<0.001，差异极显著

图6 各两两因素交互作用对桦褐孔菌多糖得率影响的响应面图

3 结束语

纤维素酶在多糖提取中可破坏细胞结构而使有效成分最大程度地溶出，因提取条件温和、能耗低、易控制的特点而受到科研工作者的青睐[8]。优化桦褐孔菌多糖提取工艺时，需寻找最佳因素水平组合，但目前常用的正交实验设计不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的明确函数表达式即回归方程，且不能全面地研究各因素之间的交互作用，而均匀试验设计则以牺牲部分正交性、最大化地追求均匀性来达到减少试验次数为目的，在试验设计时没有考虑全部交互作用，只有通过回归分析时引入因素之间的交叉乘积项等来进行探索，导致其结果的不稳定。

相比之下，响应面分析法可连续对影响因素的各个水平进行分析，并在影响因素与响应值之间确立数学模型，具有预测性好、精度高、直观、简单的优点，因而表现出突出的优势[9]。本实验采用纤维素酶预处理结合常规水提醇沉法提取桦褐孔菌多糖，鉴于Box-Behnken设计所需的试验次数相对较少、效率更高且所有的影响因素不会同时处于高水平，所有的试验点都落在安全操作区域内等优点，在单因素实验的基础上，应用响应曲面分析法中的Box-Behnken设计方法优化桦褐孔菌多糖的提取工艺。

数据结果表明：料液比、提取温度、提取时间和酶解时间对桦褐孔菌多糖提取率的影响不是简单的线性关系，最终得到了与实验结果拟合程度较高的数学模型，经检验该模型合理可靠。同时，优化出了桦褐孔菌多糖的最佳提取工艺参数：料液比1∶30，提取温度90 ℃，提取时间5 h，酶解时间65 min，在该条件下进行验证试验得桦褐孔菌多糖得率(3.575±0.24)%，与理论值十分接近。该方法重复性好且简单环保，在一般实验室条件下都能实现，可广泛应用于桦褐孔菌多糖的提取。

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(责任编辑 何杰玲)

Optimization of Extraction Process for Polysaccharide from Inonotus Obliquus by Box-Behnken Response Surface Methodology

CAI Li，CHEN Zhong-min，WANG Fu-ping，YUAN Sen，RUAN Ting-fei

(College of Pharmacy and Biological Engineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China)

This study aimed to obtain the optimum extraction process of polysaccharide from Inonotus Obliquus. The response surface methodology(RSM) was used to optimize the extraction process.Liquid/solid ratio，extraction temperature，extraction time，enzymatic hydrolysis time were selected as independent variables on the basis of single factor experiments. The yield of polysaccharides was chosen as the response variable. An extraction condition with solid-liquid ratio 1∶30, extraction temperature 90 ℃, extraction time 5 h and enzymatic hydrolysis 65 min is optimal. The extraction yield under the optimized conditions is(3.575±0.24)%, agreeing with the predicted value. The results indicated that this method can rationally optimize extraction process of polysaccharide from Inonotus Obliquus.

inonotus; polysaccharides; Box-Behnken response surface methodology

2017-03-18

蔡丽(1991—)，女, 硕士研究生，主要从事药物合成提取及天然药物研究，E-mail：851702462@qq.com；通迅作者 陈忠敏，女，教授，主要从事药物合成提取及天然药物研究，E-mail：chenzhongmin@cqut.edu.cn。

蔡丽，陈忠敏，王富平，等.Box-Behnken响应面分析法优化桦褐孔菌多糖提取工艺[J].重庆理工大学学报(自然科学)，2017(6):113-119.

format：CAI Li，CHEN Zhong-min，WANG Fu-ping，et al.Optimization of Extraction Process for Polysaccharide from Inonotus Obliquus by Box-Behnken Response Surface Methodology[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2017(6):113-119.

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2017.06.017

R284.2

A

1674-8425(2017)06-0113-07