乌贼墨汁黑色素对小鼠体内重金属的脱除作用

袁翊朦， 李康秀， 王春琳， 母昌考， 李荣华， 宋微微

(宁波大学 海洋学院 应用海洋生物技术教育部重点实验室， 宁波 315211)

乌贼墨汁黑色素对小鼠体内重金属的脱除作用

袁翊朦， 李康秀， 王春琳， 母昌考， 李荣华， 宋微微

(宁波大学 海洋学院 应用海洋生物技术教育部重点实验室， 宁波 315211)

研究了乌贼墨汁黑色素对小鼠体内重金属的脱除作用。将小鼠随机分为4组，正常对照组、黑色素组、重金属组、重金属和黑色素组，分别灌胃生理盐水、黑色素悬浊液、重金属溶液、重金属和黑色素混合液。连续灌胃7 d后，计算脾脏指数，测定小鼠血液、股骨和粪便中重金属铅(Pb)、镉(Cd)、铬(Cr)、钡(Ba)含量，以及肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、丙二醛(MDA)含量。结果显示，灌胃重金属和黑色素后，与重金属组相比，Pb、Cr、Ba在血液、股骨中含量显著下降，在粪便中含量显著上升；Cd在血液、股骨中含量也降低，在粪便中含量显著上升。灌胃黑色素后，与正常组相比，脾脏指数变化不显著；SOD、GSH-Px活力下降，MDA含量上升。提示乌贼墨汁黑色素对Pb、Cd、Cr、Ba有减少吸收，促进排出的作用，具体机制有待进一步研究。

乌贼墨汁黑色素；脱除；重金属

随着工业的发展，重金属资源得到大力开发，它们可经多种途径进入人体，对健康构成威胁。Pb、Cd、Cr和Ba是常见的有毒重金属。Pb可经消化道、呼吸道进入人体，烷基铅可经皮肤吸收，对神经系统、造血系统、肝脏、肾脏等造成损害[1]。儿童血铅事件的发生，使Pb污染备受关注。Cd为已知最易在体内蓄积的毒物。研究证明，无论从毒性还是蓄积作用看，Cd已成为继Hg、Pb之后威胁人类健康的第3位金属元素[2]，在水稻、贝类中时有超标。Cr中毒大都由Cr(VI)引起，它可影响机体氧化、还原和水解过程，刺激皮肤黏膜，有致癌作用[3]。溶解度较大的钡盐，毒性较大，过量摄入可引起急、慢性Ba中毒, 有肌肉毒性、免疫毒性、生殖毒性，会导致遗传毒理上的三致效应(致突变(mutagenesis)、致癌(carcinogenesis)和致畸(teratogenesis)效应)[4]。

乌贼墨是乌贼遇到天敌时喷出的黑色物质，化学成分主要为黑色素和蛋白多糖复合体[5]，具有抗肿瘤[6]、抗氧化[7]、抗菌[8-9]、抗辐射[10-11]等生物活性。乌贼墨黑色素由黑色素单体(包括5, 6-二羟基吲哚和 5, 6-二羟基吲哚-2-羧酸)堆积而成，它存在不同的基团，如-COOH、-NH2、-OH等，具有结合潜在毒性阳离子(如一些过渡金属)的特性。Lian等[12]利用红外吸收光谱法检测了乌贼墨黑色素颗粒与二价阳离子Mg2+、Ca2+、Zn2+和Cu2+的结合，发现金属离子和黑色素的-COOH、-NH2和-OH等官能团相互作用。刘漫等[13]进行了乌贼墨黑色素吸附溶液中Pb2+的实验，分别考察了初始离子浓度、溶液pH值、吸附温度、吸附作用时间、乌贼墨黑色素添加量对吸附的影响。吕玲等[14]对24 h内Pb中毒小鼠进行乌贼墨黑色素灌胃治疗，测定小鼠血液、肝脏以及脑组织中的Pb含量，发现排Pb效果显著。吕玲等[15]进行了不同剂量乌贼墨黑色素排Pb作用，及其对体内Ca、Zn、Cu含量影响的研究。可见，体内和体外实验已表明，乌贼墨黑色素对Pb有脱除作用。而乌贼墨黑色素对其他重金属的体内代谢作用还没有报道。另外，已有研究表明，其他来源的黑色素可脱除生物体内重金属。Nogaj等[16]通过小鼠体内实验表明外源添加人工合成的黑色素对Zn2+和Co2+离子的体内分布、排出以及蓄积有显著影响。王哲鹏等[17]发现乌鸡黑色素在果蝇体内具有一定排Pb解毒作用。神经黑色素能够与Fe、Zn、Cu、Mn、Cr、Co、Hg、Pb和Cd等结合[18]，其中与Fe的作用可能和帕金森病有关[19]。雷敏等[20]经小鼠灌胃后发现，鱿鱼墨黑色素能阻碍Pb、Cd、Cr、Ba在小鼠体内的吸收和累积，促进排出体外。

基于重金属污染的严重性和乌贼墨汁黑色素脱除体内重金属的潜能，本研究以小鼠为研究对象，灌胃重金属溶液和乌贼墨汁黑色素溶液，计算脏器指数，测定血液、股骨、粪便中的重金属含量及酶活，以分析乌贼墨汁黑色素对小鼠体内重金属的脱除作用，为黑色素脱除生物体内重金属和乌贼资源的充分利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

曼氏无针乌贼购自福建东海区渔民，收集墨囊重量为：(3.0±0.5)g。ICR种类健康小鼠40只，(36.0±4.3)g，雌雄不限，随机挑选，由宁波大学医学院实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器

Ba(OH)2·6H2O、CrCl2、PbAc2、CdCl2·2.5H2O、生理盐水(国药集团化学试剂有限公司)；蛋白定量检测试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD)、微量丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；SPECTRA max190酶标仪(Molecular Devices 公司)；重金属检测仪(加拿大AVVOR)；FreeZone4.5 台式冷冻干燥机(Labconco公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 黑色素的提取

[21]，并通过实验室已有优化的方案，采用酶解法制备较高浓度的曼氏无针乌贼墨汁黑色素，主要的工艺流程如下：剖开乌贼腹部，取出墨囊，并剪开囊膜，挤出墨汁。加入蒸馏水搅拌、洗涤，用粗滤布除去杂物后，用碱液调至pH 10.5；在搅拌下，加碱性蛋白酶水解4 h，酶解温度为50℃，95℃加热10 min终止反应，8000 r/min室温下离心收集沉淀；所得沉淀物经蒸馏水反复洗涤、离心，至洗涤水为中性，真空冷冻干燥。以生理盐水配成悬浊液，4℃冷藏保存备用。

1.3.2 动物分组及实验

将40只小鼠随机分为正常组(N)，黑色素组(M)、重金属组(H)、重金属和黑色素组(HM)，每组10只，分别灌胃等体积生理盐水、黑色素悬浊液、重金属溶液(Pb2+、Cd2+、Cr2+和Ba2+混合溶液)，重金属和黑色素混合液。135.7 mg黑色素用100 mL生理盐水配置。重金属溶液配置见表1[20]，重金属用等体积生理盐水溶解。重金属和黑色素混合液中，黑色素与重金属质量比为1∶1，用等体积生理盐水配置。每组灌胃液体均为100 mL/kg·bw·d。每3 d称体重，按照体重灌胃，1次/d，连续灌胃7 d。每天收集小鼠粪便。最后1次给药灌胃后禁食不禁水12 h，称重后，摘眼球取血，脱颈椎处死小鼠，仔细剥离脾脏、肝脏、股骨。称量脾脏的质量，计算脾脏/体重的比值。其余组织-80℃保存备用。

表1 重金属溶液的配置[20](Vc调pH=4.0)

1.3.3 脾脏指数的计算

解剖时，称量脾脏及体重，计算脾脏指数。计算公式如下：

脾脏指数=脾脏鲜重(mg)/体重(g)

1.3.4 血液、股骨和粪便中重金属含量的测定

采用消化法处理血液样品。吸取一定体积的血样于250 mL消化瓶，加入浓酸混合液(浓硝酸∶高氯酸=4∶1)。将消化瓶放到可调温电炉上，先小火均匀加热，当气泡减少时，加大火力，直至瓶内溶液呈澄清的无色或淡黄色。冷却至室温，将消化液转移至25 mL容量瓶，定容。

采用灰化法处理粪便和股骨样品。干净坩埚，经稀盐酸处理，在马弗炉内加热至550℃～600℃，30 min后取出，于干燥器中冷却至室温。分别称取粪便样品5 g，置于已称重的坩埚中，在电炉上烧至无烟后，再移入马弗炉内加热至550℃，直至样本呈现白色残渣(碳化完全)。于干燥器中冷却至室温后，用10%硝酸溶解，定容至25 mL。同法处理股骨样品。

以上处理过的血液、股骨和粪便，利用重金属检测仪，测定样品中的Pb、Cd、Cr和Ba含量。

1.3.5 生化指标的测定

取小鼠部分肝脏，称量，按重量(g)∶体积(mL)为1∶9 的比例加入9倍体积的预冷生理盐水，用内切式组织匀浆机坐冰匀浆，制得10%的组织匀浆。2500 r/min离心10 min，取上清液置于-80℃冰箱备用。测定蛋白含量(考马斯亮蓝法)，测定小鼠肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，丙二醛(MDA)含量，均按照试剂盒说明书进行。

1.3.6 统计学处理

实验结果用平均值±标准差表示，使用SPSS 13.0进行统计分析，组间差异采用t检验。以P<0.05为统计学显著意义。

2 结果

2.1 不同处理组小鼠的脾脏指数

不同处理组小鼠脾脏指数结果见表2。与正常组相比，灌胃黑色素后，脾脏指数上升8.56%；灌胃重金属后，脾脏指数上升11.92%，均无显著变化。与重金属组相比，灌胃重金属和黑色素后，脾脏指数上升19.57%，变化不显著。

2.2 小鼠各组织中重金属的含量

2.2.1 小鼠各组织中Pb的含量

不同处理组3种组织中Pb含量结果见表3。与正常组相比，灌胃黑色素后，血液、股骨和粪便中Pb含量分别上升2.75%、7.32%和0.54%，变化不显著。灌胃重金属后，与正常组相比，血液、粪便中Pb含量变化显著(P<0.01)，分别上升112.01%和119.00%，股骨中Pb含量上升31.71%，但不显著。与重金属组相比，重金属和黑色素组，血液和股骨中Pb含量均显著下降(P<0.01)，分别为32.15%和24.07%，粪便中Pb含量显著上升37.47%(P<0.01)。

表2 不同处理组小鼠脾脏指数

注：与正常对照组相比，“#”P<0.05；“##”P<0.01；与重金属组相比

“*”P<0.05；“**”P<0.01。下同

表3 不同处理组小鼠各组织中Pb的含量

2.2.2 小鼠各组织中Cd的含量

不同处理组3种组织中Cd含量结果见表4。与正常组相比，灌胃黑色素后，血液、股骨中Cd含量变化不显著，粪便中Cd含量变化显著，上升31.38%(P<0.01)。灌胃重金属后，与正常组相比，血液、粪便中Cd含量变化显著，分别上升117.56%(P<0.01)、78.46%(P<0.01)；股骨上升6.25%，变化不显著。与重金属组相比，灌胃重金属和黑色素后，血液、股骨中Cd含量分别下降52.98%(P<0.01)和11.76%，粪便中Cd含量上升14.40%(P<0.01)。

表4 不同处理组小鼠各组织中Cd的含量

2.2.3 小鼠各组织中Cr的含量

不同处理组3种组织中Cr含量结果见表5。与正常组相比，灌胃黑色素后，血液中Cr含量无明显变化，股骨、粪便中也无明显变化，分别上升4.55%和9.10%。灌胃重金属后，与正常组相比，血液、股骨、粪便中Cr含量有显著上升，分别变化27.50%(P<0.01)、79.55%(P<0.01)及80.88%(P<0.01)。重金属和黑色素组，与重金属组相比，血液、股骨中Cr含量分别降低17.60%(P<0.01)及51.90%(P<0.01)，粪便中上升57.07%(P<0.01)。

表5 不同处理组小鼠各组织中Cr的含量

2.2.4 小鼠各组织中Ba的含量

不同处理组3种组织中Ba含量结果见表6。与正常组相比，灌胃黑色素后，血液、股骨、粪便中Ba含量分别上升4.47%、8.33%和10.23%，差异不显著。灌胃重金属后，与正常组相比，血液、股骨、粪便中Ba含量分别上升81.64%(P<0.01)、43.56%(P<0.05)及60.45%(P<0.01)，均差异显著。与重金属组相比，重金属和黑色素组中，血液、股骨中Ba含量变化显著，分别下降41.94%(P<0.01)和42.48%(P<0.01)，粪便中Ba含量上升28.25%(P<0.01)。

表6 不同处理组小鼠各组织中Ba的含量

2.3 不同处理组小鼠肝脏SOD、GSH-Px活力和MDA含量

不同处理组小鼠肝脏酶活和MDA含量结果见表7。与正常组相比，灌胃黑色素后，肝脏中SOD、GSH-Px活力分别降低19.40%(P<0.05)和14.16%；MDA含量升高35.41%，变化不显著。灌胃重金属后，与正常组相比，SOD、GSH-Px活力分别降低21.91%(P<0.01)和12.14%；MDA含量升高49.65%(P<0.05)。与重金属组相比，灌胃重金属和黑色素后，SOD活力变化显著(P<0.01)，GSH-Px活力和MDA含量变化不显著，分别增加21.99%、1.79%和15.64%。

表7 不同处理组小鼠肝脏SOD、GSH-Px活力和MDA含量

3 讨论

重金属经胃肠道摄入后，可进入血液循环，经代谢转化，蓄积在组织器官中，造成多种形式的损伤。而乌贼墨汁黑色素中的-COOH、-NH2、-OH等基团，具有结合潜在毒性阳离子的特性。另外黑色素还具有增强免疫功能[22]、抗氧化[7]等生物活性。本文通过灌胃小鼠观察了乌贼墨汁黑色素对Pb、Cd、Cr和Ba的脱除作用，以及对小鼠脾脏和肝脏的影响。

研究发现单独灌胃黑色素后，小鼠血液、股骨、粪便中Pb含量变化不显著，说明黑色素对内源性Pb脱除不明显。灌胃重金属组血液和粪便中Pb显著上升，股骨变化不显著；混合灌胃黑色素和重金属组血液、股骨中Pb显著下降，粪便中Pb显著上升，可以看出黑色素能够减少机体对Pb吸收和蓄积，促进排出。吕玲等[15]发现高剂量、中剂量乌贼墨黑色素对血液、肝脏有一定的排Pb作用。虽然乌贼墨来源不同，但都呈现排Pb的效果。

灌胃黑色素对小鼠血液、股骨中Cd含量影响不明显，粪便中Cd含量显著上升。灌胃重金属组血液和粪便中Cd含量显著上升，股骨中Cd含量变化不显著；混合灌胃黑色素和重金属组血液中Cd含量显著降低，粪便中显著上升，说明黑色素对Cd也具有脱除效果。

Ba和Cr在不同处理中的含量变化趋势一致。单独灌胃黑色素时，血液、股骨和粪便中的Ba和Cr含量均无明显变化，说明黑色素对内源性Ba和Cr脱除效果不明显。灌胃重金属组血液、股骨和粪便中Ba和Cr含量均显著上升；混合灌胃黑色素和重金属组Ba和Cr在血液、股骨中显著下降，在粪便中显著上升，说明乌贼墨汁黑色素对Ba和Cr脱除效果明显。

脾脏是重要的免疫器官，含大量巨噬细胞和淋巴细胞，参与体液免疫和细胞免疫。脾脏指数，在一定程度上反映了机体的免疫功能状态。本实验中，脾脏指数是几种元素综合作用的结果，重金属组小鼠脾脏指数没有显著变化，说明短期的攻毒实验没有造成内脏的损伤。同时，在黑色素的作用下，脾脏指数变化不显著，也说明了黑色素灌胃的安全性。

肝脏能参与机体解毒及排泄过程，是重金属在体内代谢最活跃的器官之一。重金属可诱导产生自由基[23]，自由基会和脂质发生过氧化反应，导致终产物丙二醛(MDA)在体内积累，造成氧化损伤。抗氧化酶和抗氧化物质，能够及时清除自由基，保护组织细胞免受其破坏。另一方面，重金属会与抗氧化酶相互作用而影响酶活性[24-25]。本实验中，灌胃黑色素后，SOD、GSH-Px活力较正常组下降，MDA含量上升。黑色素作为一种独特的高分子聚合物，不仅能清除自由基，还具有自由基特性[26]。正常机体内，抗氧化系统处于平衡状态，可能乌贼墨汁黑色素介导自由基信号转导，反馈调节了抗氧化酶。与重金属组相比，灌胃重金属和黑色素后，SOD活力显著上升，GSH-Px活力也有所上升，说明乌贼墨汁黑色素可有效抵抗重金属引起的氧化损伤，与已有研究中[20,27-28]黑色素通过提高SOD，GSH-Px活力，而起到抗氧化作用的结果一致。

综上所述，乌贼墨汁黑色素对Pb、Cd、Cr和Ba有减少吸收、促进排出的作用，对不同重金属离子的脱除作用存在差异，一方面是4种重金属离子在体内的富集方式存在差异，另一方面黑色素对4种离子的作用效果也有差别。同时黑色素对小鼠脾脏无明显损伤，还可以经过提高抗氧化酶的活力，来抵抗重金属引起的氧化损伤。具体机制有待进一步探讨，比如乌贼墨汁黑色素在机体内的转运分布情况，不同元素之间的交互作用，黑色素在促进有毒金属排出的同时，对必需金属(如Ca、Zn)是否具有亲和力等，以确定其安全性，为机体重金属脱除剂的应用提供依据。

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Removal of heavy metals in mice by melanin from sepia

YUAN Yi-meng, LI Kang-xiu, WANG Chun-lin, MU Chang-kao, LI Rong-hua, SONG Wei-wei

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, School of Marine Science of Ningbo University， Ningbo 315211, China)

In this study, we used mouse model to analyze the removal of heavy metals by melanin extracted from sepia. The mice were randomly divided into 4 groups: as the control group, melanin group, heavy metals group, heavy metals and melanin group, which were treated by gavage with saline, melanin, heavy metals, heavy metals and melanin, respectively. After a trial period of 7 days, we calculated the data of experimental animals, such as spleen index, heavy metal(Pb,Cd,Cr and Ba) contents in different organs, activities of enzymes (SOD,GSH-Px)， and the content of MDA. The results showed that Pb, Cr and Ba contents decreased significantly in blood and femur, and increased significantly in feces after heavy metals and melanin were administered compared with the heavy metals group. Besides, in contrast with heavy metals group, Cd content in of the heavy metals and melanin group dropped in blood and femur, and significantly rised in feces as well. As for melanin group, it had no significant change in spleen index by comparison with the control group. The activities of SOD, GSH-Px in melanin group were lower than the control group while the content of MDA was higher. Thus, sepia melanin appeared to help reduce Pb, Cd, Cr and Ba absorption and promote excretion.

melanin from sepia； removal； heavy metals

2016-07-04；

2016-07-19

国家自然科学基金项目(41206114，41176124)；浙江省自然科学基金项目(LQ12C19002)；浙江省自然科学基金重点项目(Z3110482)；宁波市重点农业项目(2014C11001)；宁波大学“水产”浙江省重中之重开放基金

袁翊朦，硕士研究生，研究方向为海洋天然产物利用，E-mail:ahyfyym@yeah.net

宋微微，讲师，研究方向为海洋天然产物利用，E-mail: songweiwei@nbu.edu.cn

R595.2; R285.5

A

2095-1736(2017)03-0037-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.037