霍山产铜皮石斛多糖含量测定及其卤虫毒活性研究

司华阳， 陈乃富， 陈乃东

(1. 安徽中医药大学 药学院， 合肥 230032； 2. 皖西学院 生物与制药工程学院， 六安 237012； 3. 皖西中药与天然药物工程技术研究中心， 六安 237012)

霍山产铜皮石斛多糖含量测定及其卤虫毒活性研究

司华阳1,2， 陈乃富2,3， 陈乃东2,3

(1. 安徽中医药大学 药学院， 合肥 230032； 2. 皖西学院 生物与制药工程学院， 六安 237012； 3. 皖西中药与天然药物工程技术研究中心， 六安 237012)

基于正交试验探究提取次数、料液比、提取时间及温度对多糖提取的影响。以卤虫的校正死亡率及LD50值评价铜皮石斛多糖的卤虫毒活性。实验结果显示，对铜皮石斛多糖提取的影响因素从小到大依次为：提取次数<料液比<提取时间<温度，最佳提取条件为料液比1∶40、提取2 h、浸提温度60 ℃、提取3次。铜皮石斛多糖卤虫毒活性研究表明，在4 h、8 h和12 h的LD50值分别为1.03、0.66和0.38 mg/mL，相同给药时间内，多糖对卤虫毒性的强弱随浓度的增高而增高，表现出明显的量效关系。在最优提取条件下测得霍山产铜皮石斛多糖含量为25.24%；铜皮石斛多糖具有显著的卤虫毒活性。

铜皮石斛；多糖；卤虫毒；校正死亡率

铜皮石斛[Dendrobiummoniliforme(Linn.)Sw.]，即细茎石斛，为兰科石斛属多年生草本植物，又称清水山石斛、台湾石斛，具有散风止痛、清热利湿等功效，在民间常用于治疗消化不良、痈疮肿痛、风湿疼痛等疾病[1]。现代化学研究及药理研究表明，铜皮石斛中主要含有多糖[2]、生物碱[2]、联苄类[3]和菲类[4]等多种生物活性成分，具有免疫调节、降血糖、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性[5]。铜皮石斛作为我国传统中药材“铜皮枫斗”的原材料，具有良好的药用价值及应用前景。

卤虫(Artemia)属甲壳动物亚门(Crustacea)鳃足纲(Branchiopoda)无甲目(Anostaca)卤虫科 (Artemidae)[6]，被广泛应用于现代生理学[7]、毒理学[8]、生态学[9]等学科的研究中。现代研究表明，药物的卤虫毒活性与其细胞毒活性存在相关性[10-12]，目前通过卤虫毒活性实验对药物是否具有抗肿瘤活性进行早期筛选的研究已有大量文献报道[13-16]。截至目前，尚未见天然来源的多糖卤虫毒活性研究报道。

为了探讨多糖类物质卤虫毒活性，本实验首先对霍山产铜皮石斛最佳提取工艺条件进行优化，在确定的最佳工艺条件下提取霍山产铁皮石斛多糖，采用卤虫毒活性筛选模型，对其抗肿瘤活性进行测定，为卤虫用于天然药物抗肿瘤活性评价积累实验数据，为霍山产石斛资源开发提供依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1 实验材料

实验所用铜皮石斛于2013年6月采自安徽省霍山县太平畈乡，经皖西学院植物细胞工程生物技术研究中心主任陈乃富教授鉴定确认为铜皮石斛[Dendrobiummoniliforme(Linn.)Sw.]。剪取当年生枝条，去叶备用。

卤虫卵(Artemiasalina)于2013年8月购自山东滨州金太阳生物科技有限公司。

1.2 实验仪器

旋转蒸发器(RE-52D型，上海浦沪仪器厂)；双光束紫外-可见分光光度计(TU-1901型，北京普析通用仪器有限公司)；离心机(GL-200-II型，上海安亭科学仪器厂)；电子天平(GL-20G-II型，上海安亭科学仪器厂)。

1.3 实验试剂

甲醇(河北四友卓越科技有限公司)；无水乙醇(山东临沂贝斯特化工有限公司)；无水乙醚、丙酮(上海振兴化工一厂)；氯仿(武汉市鑫民族化工有限公司)；正丁醇(淄博品易经贸有限公司)；蒽酮(阿拉丁试剂公司)；浓硫酸(汕头市西陇化工厂有限公司)。以上试剂药品均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 多糖提取

将铜皮石斛切成薄片，60℃烘干至恒重，精确称取5.0 g样品于85℃无水乙醇冷凝回流提取脱色、脱脂，滤纸过滤，室温下将所得药渣中残留有机试剂自然挥干，加入双蒸水于80℃水浴冷凝回流浸提所得药渣[17]。合并滤液并减压浓缩获得浓缩后的铜皮石斛粗多糖溶液。

2.2 多糖纯化

将合并后的粗多糖浸提液定容至一定体积，4倍体积无水乙醇沉淀多糖，4℃冰箱静置12 h，4000 r/min离心5 min，反复操作3～4次[18]，合并所得沉淀，加入适量双蒸水溶解，采用Sevage法除蛋白(氯仿∶正丁醇=4∶1)[19-20]，收集去蛋白后的上层水相，40℃减压浓缩蒸干，得精制多糖。

2.3 多糖含量测定

2.3.1 标准曲线绘制

配置0.1 mg/mL的标准葡萄糖母液。分别精确量取0、0.1、0.2、0.4 、0.6、0.8和1.0 mL葡萄糖标准母液于各试管中，双蒸水定容至1.0 mL，按体积比1∶4加入 0.2%蒽酮-硫酸溶液显色，震荡均匀，冷却至室温后，置于沸水浴中加热10 min，取出后，冷却至室温，双蒸水作空白对照，于620 nm进行紫外检测[21]。以浓度(C)为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线(图1)，求得回归方程。

图1 葡萄糖标准溶液曲线

2.3.2 稳定性试验

精确量取标准葡萄糖母液0.2 mL，按2.3.1所述操作步骤测定其吸光度，在620 nm处分别于0、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0 h测定吸光度。结果显示该显色在6.0 h内稳定。

2.3.3 精密度试验

精确量取标准葡萄糖母液0.2 mL，按2.3.1所述操作述步骤在620 nm处测定吸光度，测定5 次。结果显示，RSD=2.6%。

2.3.4 换算因子的测定

精密称取铜皮石斛精制多糖10.0 mg，配置成0.1 mg/mL溶液，精确量取两种精制多糖溶液各1.0 mL，按2.3.1所述步骤检测其吸光度，以双蒸水做对照实验，实验设3组重复。

计算换算因子(F)：

F=W/(C×D)

其中：W为铜皮石斛多糖的质量(mg)；C为多糖溶液中所含葡萄糖的浓度(mg/mL)；D为稀释倍数。

2.3.5 多糖提取液的制备

按2.1方法对干品霍山产铜皮石斛进行初步脱色、脱脂处理后，以蒸馏水为提取溶剂，按一定的料液比(g/mL)、提取时间、温度、提取次数浸提，浸提液趁热过滤，定容，制得霍山产铜皮石斛多糖浸提液。

2.3.6 多糖含量测定

精密称取铜皮石斛多糖提取液1.0 mL，双蒸水配置成0.1 mg/mL的多糖溶液，按2.3.1所述操作测定其吸光度，以双蒸水代替多糖做空白实验，计算铜皮石斛多糖含量:

多糖含量(%)=(C×D×F×V)/W×100%

其中：C为样品液中所含葡萄糖的浓度(mg/mL)；D为样品溶液稀释倍数；F为换算因子；V为样品溶液体积(mL)；W为药材干重(mg)。

2.4 提取条件优化

2.4.1 单因素试验

以双蒸水为提取溶剂，考查提取次数、料液比、提取时间、温度等对铜皮石斛多糖提取的影响。

精确称取5.0 g铜皮石斛样品若干份，按表1设计进行单因素实验，考察不同提取因素对铜皮石斛多糖提取的影响。当考察一个因素影响时，其他3个因素均采用第3水平代表的条件。

表1 单因素实验设计

2.4.2 正交试验

根据单因素试验结果，确定各因素水平，按L9(34)正交设计正交试验，确定霍山产铜皮石斛多糖的最佳提取工艺条件，各因素及水平设计见表2，每组实验重复3次。

2.5 卤虫毒活性测定

2.5.1 卤虫毒活性实验

按照Nondo[22]、Lin[23]、Badisa[24]及本实验室已发表的研究方法进行卤虫毒活性研究实验[25]。在不加样连续培养14～15 h后，观察发现培养的卤虫存活率不足50%，因此，选取4、8和12 h培养后的卤虫存活数作为评价指标。

表2 L9(34)正交试验水平表

2.5.2 卤虫毒活性计算方法

采用校正死亡率作为霍山产铜皮石斛多糖的卤虫毒活性评价指标，计算方法如下：

校正死亡率(%)=(空白存活数-加样存活数)/空白存活数×100%

LD50值为校正死亡率为50%时的药物浓度，不同浓度的卤虫数存活数取其平均值通过LD50算出卤虫毒活性。

3 结果与分析

3.1 提取次数对多糖提取的影响

实验结果显示(图2)，铜皮石斛多糖含量随着浸提次数增长逐渐增长，浸提3次后，测得的多糖含量增长不明显，表明样品中所含的多糖接近提取完全。因此选择浸提2次、3次和4次作为正交试验考察范围。

图2 提取次数对多糖提取的影响

3.2 料液比对多糖提取的影响

实验结果显示(图3)，随料液比的增长提取测得的铜皮石斛多糖含量逐渐增长，当料液比超过1∶40之后，多糖含量变化不大，因此，在正交试验中对其进一步优化，其考察水平选为1∶30，1∶40和1∶50。

图3 料液比对多糖提取的影响

3.3 提取时间对多糖提取的影响

实验结果显示(图4)，随浸提时间的增长提取测得的铜皮石斛多糖含量逐渐增多，2 h时提取测得的铜皮石斛多糖含量最高，随后开始下降。可能是因为随着浸提时间的增加，铜皮石斛中多糖提取逐渐完全，随着浸提时间的延长，多糖在持续高温下可能发生断链降解，导致多糖提取含量降低。因此，在正交试验中对其进一步优化，其考察范围选为1～2 h。

图4 提取时间对多糖提取的影响

3.4 提取温度对多糖提取的影响

实验结果显示(图5)，随浸提温度的增长提取测得的铜皮石斛多糖含量逐渐增多，60℃浸提时多糖含量几乎达到最大值，80℃提取测得的多糖含量较60℃提取增加不明显，随后开始呈现下降趋势，这可能因为随着提取温度的增加植物细胞结构被破坏，分子热运动加速，从而使多糖充分溶出，当温度过高时，可能导致多糖分子结构的分解，导致多糖得率逐渐降低。因此，在正交试验中对其进一步优化，其考察水平选为40℃，60℃和80℃。

图5 提取温度对多糖提取的影响

3.5 正交试验

根据单因素实验结果，以 L9( 43) 正交试验设计对铜皮石斛提取条件进行优化。探究霍山产铜皮石斛多糖的最佳提取条件，实验结果见表3,方差分析结果见表4。

由表3中的R值可知，在选取的考察因素中，对多糖提取的影响由大到小依次为温度>提取时间>提取次数>料液比。从表4结果中可看出，温度、提取时间、提取次数和料液比对铜皮石斛多糖含量具有显著影响。由k值大小可知，在本实验条件下铜皮石斛多糖的最佳提取条件组合为A2B2C3D2，此结果与单因素实验结果基本相似。在此条件下提取测得霍山产铜皮石斛的多糖含量为25.24%。

3.6 卤虫毒活性研究

霍山产铜皮石斛精制多糖的卤虫毒活性校正死亡率结果如表5所示。在选取的给药培养时间内，测得的卤虫校正死亡率与不同培养时间内的铜皮石斛多糖浓度均具有显著的量效关系与时效关系：随着多糖浓度的增大卤虫的校正死亡率逐渐上升，当给药浓度超过1.0 mg/mL时，校正死亡率上升趋于平缓。此外，同一给药浓度，随着培养时间的延长，卤虫的存活个数越少，存活率越低。

表3 正交试验设计与结果分析

表4 方差分析

表5 铜皮石斛多糖校正死亡率 (n=3)

经LSD检验，4、8和12 h各剂量组，卤虫毒活性差异均有统计学意义(P≤0.5)。

铜皮石斛多糖的LD50值计算结果表明，给药培养4 h时铜皮石斛多糖对卤虫毒活性的LD50值为1.03 mg/mL，8 h时卤虫毒活性的LD50值为0.66 mg/mL，12 h时卤虫毒活性的LD50值为0.38 mg/mL。分析表明，铜皮石斛多糖的卤虫毒活性与给药时间具有一定的相关性。

4 讨论与结论

正交试验结果表明，影响多糖提取因素的先后顺序为温度>提取时间>提取次数>料液比，霍山产铜皮石斛多糖的最佳提取条件为：料液比1∶40，60℃提取3次，每次2 h。此外，本实验揭示了铜皮石斛多糖具有明显的卤虫毒活性，在选取的给药培养时间内，测得的卤虫校正死亡率与不同培养时间内的铜皮石斛多糖浓度均具有显著的量效关系与时效关系，4、8和12 h卤虫毒的LD50值分别为1.03、0.66和0.38 mg/mL，本实验室前期研究结果表明[25]，4、8和12 h铁皮石斛多糖卤虫毒的LD50值分别为(5.8±1.4) mg/mL、(1.7±3.1)mg/mL和(0.41±0.04) mg/mL，表明铜皮石斛多糖具有更强的卤虫毒活性。

铜皮石斛作为我国传统中药材“铜皮枫斗”的原材料，具有良好的药用价值及食用价值，其植株中含有多种生物活性成分，多糖含量尤为丰富。现代药理研究表明，多糖具有广泛的药理活性。本实验以卤虫的校正死亡率评价指标，发现铜皮石斛多糖具有较强的卤虫毒活性，在相同浓度及同一时间内，相较于铁皮石斛多糖，铜皮石斛多糖卤虫毒的LD50值更低，推测可能是由两种石斛多糖的单糖组成差异造成的。因此，在本实验基础上，可进一步研究两种石斛的单糖组成及各组成单糖的含量，结合本实验结果进行相关性分析，以期进一步揭示两种石斛多糖的卤虫毒活性差异机制。

[1]黄 双,赵 鹏,李 彬,等.铜皮枫斗对老龄大鼠的抗氧化作用[J].应用预防医学, 2013,19(6):377-379.

[2]陈云龙,张 铭,华允芬,等.细茎石解不同部位有效成分及分布规律研究[J].中国中药杂志, 2001, 26(10):709-710.

[3]BI Z M, YANG L. A new bibenzyl derivative fromDendrobiummoniliforme[J]. Chinese Chemical Letters， 2002, 13(6):535-536.

[4]LIN T H, CHANG S J. Two phenanthraquinones fromDendrobiummoniliforme[J].Journal of Natural Products， 2001, 64(8): 1084-1086.

[5]陈超琴,蒋丽华,赵黎明,等.石斛多糖的研究进展[J].食品工业科技, 2012, 3(2): 41-45.

[6]侯 林,邹向阳,姚 锋，等.卤虫的生物学研究[J].生态学通报,2005,40(7):4-6.

[7]杨春艳.用卤虫和A549癌细胞筛选内生真菌抗癌活性的对比分析[J].云南民族大学学报,2009,18(3):250-254.

[8]刘 绮.卤虫对毒物毒性监测方法研究[J].环境科学与技术,2000(4):35-37.

[9]吴宗凡,刘兴国,王高学.重金属与有机磷农药二元混合物对卤虫联合毒性的评价及预测[J].生态毒理学报,2013,8(4):602-608.

[10]JEON S H, CHUN W, CHOI Y J, et al. Cytotoxic constituents from the Bark ofSalixhulteni[J]. Archives of Pharmacal Research, 2008, 31(8): 978-982.

[11]LUO X M, HE W H, YIN H, et al. Two new coumarins fromMicromelumfalcatumwith cytotoxicity and brine shrimp larvae toxicity [J].Molecules, 2012, 17:6944-6952.

[12]HULLATTI K K, UMA D M. Activity guided isolation of cytotoxic compounds from Indian medicinal plants using BSL bioassay [J]. Joumal of Current Pharmaceutical Research, 2010(1): 16-21.

[13]YOGESH B, YOGESHKUMAR V, SUMITRA C. Brine shrimp cytotoxicity, anti-inflammatory and analgesic properties ofWoodfordiafruticosaKurz Flowers [J]. Iranian Journal of Pharmaceutical Research， 2012, 11(3):851-861.

[14]NIPUN D, VIJAY S, KIRTI S. et al. In vitro cytotoxic activity ofDendrophthoefalacteon human breast adenocarcinoma celle-MCF-7[J]. International Journal of Cancer Research, 2011, 7(1):47-54.

[15]OLATU O, LVOPOL M, NITULESCU G, et al. Toxicity of various antimicrobial essential oils assessed usingArtemiasalinaandDaphniamagna[J]. Toxicology Letters, 2016, 258(16): 68-76.

[16]FARHANA I, TASDIQUE M Q, SHARMIN R C, et al. Antioxidant and cytotoxic activities ofMussaendamacrophylla[J]. Bangladesh Pharmaceutical Journal, 2012, 15(1): 69-71.

[17]丛 娟, 宫 莉,闫小娟.五味子多糖的提取及分离[J].食品与生物技术学报, 2011, 30(1): 90-94.

[18]刘长建,姜 波,刘 亮,等.枸杞子多糖提取工艺优化及体外抗氧化活性研究[J].时珍国医国药, 2009, 20(3):661-663.

[19]赵俊凌,马摇洁,李摇戈,等.兜唇石斛多糖提取及脱蛋白工艺研究[J].时珍国医国药, 2010, 21(8): 1884-1866.

[20]杨永东,李聪颖,唐 策,等.藏药蔓菁抗氧化性多糖的提取及纯化工艺优选[J].中国实验方剂学杂志, 2013,19(7):7-10.

[21]张 杰,李春艳,李劲平,等.蒽酮硫酸发与苯酚硫酸法测定竹节参多糖含量的比较研究[J].中南药学,2012,10(6):421-424.

[22]NONDO S O R, MBWAMBO H Z, Kidukuli W A, et al. Larvicidal, antimicrobial and brine shrimp activities of extracts fromCissampelosmucronataandTephrosiavillosafrom coast region, Tanzania[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2011(11):33.

[23]LIN X, ZHOU X, WANG F,et al. A new cytotoxic sesquiterpene quinine produced byPenicilliumsp. F00120 isolated from a deep sea sediment sample[J]. Marine Drugs, 2012, 10: 106-115.

[24]BADISA R, SELINAF D, JOSEPH P, et al. Selective cytotoxic activities of two novel synthetic drugs on human breast carcinoma MCF-7 Cells [J]. Anticancer Research, 2009, (29): 2993-2996.

[25]陈乃东, 郭 旭, 张 笠,等.铁皮石斛组培植株和大田植株中的多糖及其卤虫毒性[J].中药材, 2016,38(4):859-863.

The content and brine shrimp larvae toxicities of polysaccharide ofDendrobiummoniliformefrom Huoshan

SI Hua-yang1,2, CHEN Nai-fu2,3, CHEN Nai-dong2,3

(1. School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230032; 2. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu’an 237012; 3. West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine, West Anhui University, Lu’an 237012， China)

In order to obtain the optimum condition of the extraction and shrimp larvae toxicities of the polysaccharide fromDendrobiummoniliformefrom Huohan, the effect of the extraction times, extracting time, solid-liquid ratio and extraction temperature on the yield of the polysaccharides from the stems ofD.moniliformewere investigated by single factor experiments and orthogonal experiments, and shrimp larvae toxicity of the polysaccharide was evaluated by corrected mortality. The decreasing order of the four influencing factors affecting the polysaccharide yield were successively extraction temperature, extracting time, solid-liquid ratio and extraction times. The orthogonal experimental results showed that the optimal condition were extraction temperature, 60℃; solid-liquid ration, 1∶40; extracting time, 2 h and extraction times, 3.Being administered for 4 h, 8 h and 12 h, theLD50values of the crude were 1.03, 0.66 and 0.38 mg/mL respectively. Under this condition, the polysaccharide content was 25.24%.Remarkable shrimp larvae toxicity was showed by the polysaccharide of wildingD.moniliformefrom huoshan.

Dendrobiummoniliforme(Linn.)Sw.; polysaccharide; shrimp larvae toxicity; corrected mortality

2016-06-06；

2016-09-27

国家自然科学基金(81274021,81573536)；中国博士后基金特别资助(2016T90568)；安徽省自然科学基金面上项目(1608085MH221)；安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2016A886)；安徽省教育厅自然科学研究重大项目(2015ZD043)

司华阳，硕士研究生，研究方向为生物化学与天然药物化学，E-mail:1067027066@qq.com

陈乃富，教授，主要从事植物生化及植物资源开发应用研究，E-mail: naifuchen1962@163.com；陈乃东，博士，教授，E-mail：2004cnd@163.com

Q946

A

2095-1736(2017)03-0064-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.064