冷冻电镜单颗粒技术解析生物大分子结构综述

张世超， 欧阳燕， 刘善辉， 朱 莉

(兰州大学 生命科学学院，兰州730000)

冷冻电镜单颗粒技术解析生物大分子结构综述

张世超， 欧阳燕， 刘善辉， 朱 莉

(兰州大学 生命科学学院，兰州730000)

冷冻电镜单颗粒技术是从20世纪80年代发展起来的结构生物学新技术，特别是最近几年，由于高分辨成像设备的应用以及图像处理方法的改进，该领域取得了革命性的技术突破，分辨率达到原子水平，迅速发展成为结构生物学新的主流研究技术，尤其适合于研究生物大分子复合物的结构。简述了冷冻电镜单颗粒技术解析生物大分子结构的技术流程、最新技术进步以及未来发展方向。

冷冻电镜；单颗粒；三维重构；蛋白质结构

结构生物学通过解析生物大分子的结构来研究其发挥功能的分子机制，从而揭示细胞生命活动的分子基础。冷冻电镜单颗粒技术，发端于20世纪80年代[1-2]，是将生物大分子速冻后，在低温下利用透射电子显微镜对结构均一、分散的全同样品颗粒进行成像，再经图像处理及重构计算获得样品的三维结构。可研究生物大分子在溶液中的结构及构象变化、无需结晶、所需样品量相对较少(通常<0.1～1mg)、研究对象广泛，适合于研究>80 ku的蛋白质、病毒等生物大分子及其复合物，且样品分子量越大、对称性越高，越容易重构得到高分辨结构，目前分辨率已达到原子/近原子水平。在2013年以前，只有具备高度对称性的病毒大分子颗粒可重构得到近原子分辨率结构，如周正洪研究组于2010年发表的第一个冷冻电镜原子分辨率结构——3.3Å人腺病毒结构[3]。直到2013年，程亦凡小组解析了约300 ku膜蛋白TRVP1的3.4高分辨冷冻电镜结构[4]，标志着冷冻电镜单颗粒结构解析进入原子分辨率时代。其后，一系列样品通过这一技术重构得到原子分辨水平密度图，过去结构研究困难的一些生物大分子复合体以及低对称性、低分子量的蛋白质也纷纷解析得到原子/近原子分辨率结构，如膜蛋白γ-分泌酶(170 ku，4.5 Å)[5]、乳酸脱氢酶(145 ku，2.8 Å)[6]、核糖体(2.8 Å)[7]、剪切体(< 4 Å)[8]等。目前冷冻电镜结构解析的最高分辨率是1.8 Å(谷氨酸脱氢酶，334 ku)，实现高分辨结构解析的最小分子是异柠檬酸脱氢酶(93 ku，3.8 Å)[6]。由于其在生物大分子结构研究中无可比拟的优越性，冷冻电镜单颗粒技术正受到越来越广泛的应用，越来越多的生物大分子结构通过这一技术获得解析。

1 冷冻电镜单颗粒技术流程

1.1 样品提取纯化

对于分子量较小、内源丰度低的蛋白，可通过外源重组过量表达提取纯化；而对于外源表达纯化困难的大分子复合物，如核糖体，则一般通过组织提取方式获得。样品纯度要尽量高，一般应达到90%～95%以上，若进一步纯化很困难，后面的数据处理过程中可进行计算机纯化，即通过计算分类区分样品的不同状态。

1.2 冷冻电镜样品制备

冷冻电镜制样的目的是要获得分散性、均一性较好的样品以进行数据采集。冷冻制样，是将生物含水样品(如蛋白质溶液)用液氮/液氦冷却的液态乙烷速冻，使水分子形成非晶体玻璃态冰，样品颗粒悬浮于玻璃态冰中，以保持生物分子近天然态高分辨结构，减少电子束对样品的辐照损伤。

1.3 数据收集

生物分子，主要由C、H、O、N等元素组成，电子散射能力弱，成像衬度低。为减少辐照损伤，生物样品使用低电子剂量(通常约20 e/Å2) 成像，导致信噪比和衬度更低，成像时需要增加欠焦值以提高图像衬度。一般需要采集大量粒子，目标分辨率越高，需要粒子数越多，尤其是无对称性样品以及均一性较差的样品则需要收集更多粒子。收集数据量的大小取决于样品对称性、均一性、成像质量以及目标分辨率等因素。目前，对于非对称性分子，通过电子直接探测相机成像，达到近原子分辨率一般需要大约5～15万个粒子。

1.4 数据处理

1.4.1 粒子参数的确定与二维分类

每一个粒子的电镜图像有5个参数需要确定：两个平面内的平移自由度X、Y，一个平面内的旋转自由度γ，两个离开平面的旋转自由度α、β。平面内自由度可以通过对位加以消除，每个粒子离开平面的旋转自由度提供了粒子的三维信息。单颗粒图像处理的目的就是通过电镜重构软件计算确立每一个粒子的这些参数，常用的重构软件有EMAN2[9]、SPIDER[10]、XMIPP[11]、IMAGIC[12]等。

二维分类，是将颗粒图像对位后，根据相似性进行归类，计算每一类的二维类平均图。二维分类算法有K均值聚类算法及最大似然法。通过二维分类，可评估数据质量、粒子取向分布等样品状态。

粒子取向测定的准确度是决定重构分辨率的主要因素。电镜照片包含大量噪音信号，是影响粒子取向确定的主要限制因素。大分子颗粒可提供足够强的信号以实现准确的对位及分类，因此分子越大越容易区分异质性。低信噪比限制对位及粒子取向测定的准确度，使小分子结构解析更加困难。

1.4.2 三维重构

电镜三维重构的基本原理是DeRosier和Klug于1968年提出的中心截面定理[13]，它是指一个函数沿某方向投影函数的傅立叶变换等于此函数的傅立叶变换通过原点且垂直于此投影方向的截面函数。拍摄的电镜照片，可视为样品沿电子入射方向的二维投影，沿不同投影方向拍摄样品不同取向的一系列电镜照片，经傅立叶变换，可得到一系列不同取向的截面，当截面数足够多时，可重构出傅立叶空间的三维函数，再经傅立叶逆变换，便可得到实空间中样品的三维结构。常用的三维重构方法有角度重构法(也称共价线法)[14]与随机锥倾转法(RCT法)[15]。角度重构法适合于取向随机分布的样品，RCT法则适合于具有明显优势取向的样品。对于结构未知的样品，RCT法是获得可靠初始模型的有效方法。

1.4.3 三维分类

模型精修之前，可按照三维分类原则对粒子集进行分类，即根据粒子与一个或多个参照模型的相似度进行分类。三维分类的目的是为了区分粒子不同的取向、构象状态、结构组成等。三维分类的算法基于最大似然法原理[16]，常用软件有RELION[17-18]及FREALIGN[19]等。通过三维分类可去除低质量的数据，有助于获得高分辨结构。

1.4.4 模型精修

在获得均一的粒子集及初始三维模型后，用“投影匹配”法进行模型精修以提高分辨率。首先将每个粒子图像与初始模型的一系列二维投影图进行比对，按照与每个粒子最为相似的投影图取向，对粒子进行平移及角度参数调整，调整后的粒子再用于重构新的三维模型，新计算出来的三维模型又被用于下一轮的粒子参数优化。如此反复，直到模型投影和原始的粒子图像匹配。

颗粒对位及投影匹配时，以粒子结构中体积较大较稳定的部分为主，相对灵活的亚区分辨率相对较低。有时需要将参照模型甚至粒子图像中较大的稳定区域进行掩盖，只对灵活区域做精修，前提是目标区域能够进行准确对位，如核糖体中，小亚基相对于大亚基可呈不同的结合状态。

1.4.5 分辨率评估和结构解析

以FSC(Fourier shell correlation)曲线评估EM模型的分辨率，结果为模型整体分辨率。模型各部分结构稳定性不同，分辨率可能存在局部差异。通常位于结构中央、较稳定的部分，分辨率较高；而处于结构边缘、较灵活的区域，分辨率较低。ResMap[20]软件可评估局部分辨率。

要区分亚基边界，要求分辨率达到～15 Å以上；高于10 Å可显示α螺旋对应的棒状密度；～4 Å可显示肽链骨架；接近3 Å，可识别大多数氨基酸的侧链基团，或双链DNA/RNA的堆积碱基。近原子分辨率的EM密度图，可用X-射线晶体学建立的一套方法，直接进行原子模型的建立和精修。常用COOT[21]软件建模，REFMAC[22]软件进行精修。对于分辨率在4.5～10 Å之间的EM密度图(图1)，将结构域的已知高分辨结构进行拟合，可获得准原子模型。对于中等分辨率的密度图，通过密度差减分析、晶体结构对接等方法，可解析分子构架方式。

2 革命性的技术进步

近年来冷冻电镜领域取得突破性进展主要源于两方面的技术革新：高分辨成像设备——电子直接探测相机DDD (Direct electron detector)的应用以及图像处理技术的进步[23]。最新一代的高分辨成像设备DDD，可直接检测电子，无需进行光电信号转换，极大地提高了图像信噪比和衬度[24]。再结合优化的图像处理方法，可解析过去研究难度较高极具挑战的生物大分子机器(如核糖体、剪切体、转录复合物等)以及小分子量蛋白质(<200 ku)。

新的图像处理工具可校正电子辐射导致的样品漂移以及区分样品的不同结构状态。电子束照射会导致样品漂移，使图像模糊[25]；生物大分子结构灵活，经常存在组成或构象不均一性，对样品中不同的三维结构如未加以区分，会导致重构结构模糊。这两个问题都导致结构信息严重损失。Campbell等开发了DDD的电影成像模式，以识别并校正电子束诱导的样品漂移，从而提高单颗粒图像的信噪比[26]。Scheres将贝叶斯算法用于单颗粒分析[27]，开发了Relion软件[17-18]，成为三维分类及高分辨重构的强大工具，广受欢迎。高分辨低噪音图像使图像处理算法得以更好地执行，得到更均一、分辨率更高的数据集，使每个颗粒的取向测定更准确，两方面共同作用的效果使重构分辨率大大提高，超出人们预期。

目前，高分辨冷冻电镜结构解析可实现从头建立原子模型、观察化学小分子(如底物、配体、抑制剂等)、解析小分子蛋白复合物以及研究非均一样品等。

3 总结与展望

冷冻电镜单颗粒技术方法逐渐发展成熟，特别是在最近几年之中，取得了突飞猛进的技术进步，使分辨率大幅提升、达到原子水平，正迅速发展成为结构生物学一项主流研究技术。如今小至93 ku的蛋白(异柠檬酸脱氢酶)已能通过cryo-EM解析近原子分辨率结构。但在实际操作中有的样品很难重构得到高分辨结构，特别是分子量较小、均一性差的样品，小分子量蛋白解析结果与粒子特征是否有利于进行准确对位有关。然而即便较低分辨率的电镜密度图，也能提供一些颇有价值的结构信息，尤其是对于结构未知的样品。EM重构分辨率的提高是一个逐步改进优化实验条件的过程，从样品制备、数据收集到数据处理，每一步都需要精细控制、不断优化以至获得最佳结果。

生物分子结构灵活多变，不同功能状态下，可能具有不同构象或组装方式，通过冷冻电镜单颗粒技术观察、甄别这些结构变化，对于理解与功能相关的分子动态很重要。冷冻电镜单颗粒技术既能解析分子构架又能提供分子动态信息，对于研究生物大分子发挥功能的机制具有独特的优势，目前已吸引了越来越多的研究者应用该技术于相关研究中。

图1 EMDataBank数据库中通过冷冻电镜单颗粒技术解析的分辨率高于4 Å的EM密度图数目(2008年至2016年9月数据)Fig 1 Number of structures solved by single particle cryo-EM at a resolution of >4 Å (data released in EMDataBank from 2008 to September of 2016)

对冷冻电镜单颗粒技术的广泛关注将吸引更深入的技术研发。下一代直接电子探测设备将具备更高的信噪比，以期能够用更少的数据量实现高分辨重构，使粒子分类更准确，并且能够对小分子量样品进行高分辨重构。此外，迅速发展的相位板技术可提高电镜图像衬度，被用于记录小分子量样品的高衬度图像[28]。Cryo-EM样品制备方面，需要系统性地筛选条件或化学试剂，以增加样品稳定性、分散性及提高数据收集效率。同时，不同类型载网(如金载网[29])及样品支持膜(如石墨烯[30])的开发以改善制样效果、提高数据质量。最后，数据分析软件的优化，开发更精准的二维及三维分类工具，使能够有效区分样品异质性，实现高分辨重构。

虽然生物分子自身固有的灵活性仍然是冷冻电镜单颗粒重构的限制因素，但现代冷冻电镜单颗粒技术能够提供生物分子近生理条件下的结构与构象动态信息，对生物过程的分子机制予以前所未有的揭示。随着样品制备改进、成像设备升级以及重构算法优化，未来将有望解析小于50 ku的分子。

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A brief introduction to single-particle cryo-EM of biological macromolecules

ZHANG Shi-chao, OUYANG Yan, LIU Shan-hui, ZHU Li

(School of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) emerged as a tool to study structures of biological macromolecules (especially large complexes) ～30 years ago. Recently, due to the newly development of high-resolution imaging device and image processing methods, huge improvement in resolution has been achieved by cryo-EM single particle analysis. Nowadays it is possible to establish atomic or near-atomic structure models of lots of biological macromolecules with cryo-EM 3D reconstruction. As a result of this so-called revolutionary breakthrough, cryo-EM has been developing into a mainstream technique of structural biology in the last few years. This work introduces cryo-EM single-particle analysis of biological macromolecules and the new breakthrough in brief, and the future development is discussed as well.

cryo-EM; single particle; 3D reconstruction; protein structure

2016-09-21；

2016-09-29

国家自然科学基金青年基金项目(31401101)；中央高校基本科研业务费专项资金(lzujbky-2016-223)

张世超，博士研究生，研究方向为蛋白质结构与功能，E-mail: zhangshch08@lzu.edu.cn

朱 莉，副教授，研究方向为电镜结构生物学，E-mail: zhuli@lzu.edu.cn

Q6-33

A

2095-1736(2017)03-0074-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.074