酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯的性质及结构表征

包雪梅 牛黎莉 汪 月 曾著莉 赖兴娟 贾志春 张盛贵

(甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州 730070)

酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯的性质及结构表征

包雪梅 牛黎莉 汪 月 曾著莉 赖兴娟 贾志春 张盛贵

(甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州 730070)

为提高淀粉的反应活性，采用氢氧化钠尿素法对马铃薯原淀粉进行处理，以处理后的马铃薯淀粉和肉豆蔻酸为原料，Novozyme 435为催化剂，在无溶剂体系中制备了取代度为0.018～0.065的肉豆蔻酸淀粉酯，并对其部分理化性质进行研究。结果表明：与原淀粉相比，预处理淀粉溶解度和透明度显著增加(P<0.05)，其膨胀度、冻融稳定性、乳化性和乳化稳定性均显著降低(P<0.05)。同时，肉豆蔻酸淀粉酯的性质与其取代度密切相关，与原淀粉相比，随着取代度的增加，酯化淀粉冻融稳定性、乳化性和乳化稳定性随之升高，而其溶解度、膨胀度和透明度随之下降。扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶红外光谱分析(FTIR)、疏水性测定对预处理淀粉及不同取代度的肉豆蔻酸淀粉酯进行观察、测定、分析，结果表明，淀粉颗粒结构被破坏，酯化淀粉具有较好的疏水性，FTIR验证了预处理淀粉及酯化淀粉的生成。

酶促合成 马铃薯 淀粉 肉豆蔻酸淀粉酯 性质

由于马铃薯淀粉含有天然的磷酸基团，具有高黏性、高聚合度及其口味温和无刺激等优点而被广泛应用[1]，但马铃薯原淀粉存在冷水不溶、糊热稳定性差及抗剪切性能差等缺点，限制了马铃薯淀粉的应用[2-3]。通过引入中长链脂肪酸，来改善淀粉的物化性质，并使淀粉具备亲水亲油的“双亲”性质是淀粉改性研究的热点之一。

肉豆蔻酸即十四烷酸，属于中长链脂肪酸，其价格低廉，来源广泛，肉豆蔻酸及其衍生物广泛应用于化妆品、高分子材料、食品等行业。目前，国内外报道的制备酯化淀粉合成方法主要有水媒法、溶剂法、熔融法等，而以脂肪酶为催化剂的合成方法则为少见[4]。酶法具有生产成本低、反应条件温和、选择性高、副产物少，绿色环保等优点，可广泛应用于食品和生物制药等行业[5]。李贺等[6]研究了以Novozyme 435作为催化剂，酶促合成松香酸淀粉酯并对不同取代度淀粉酯的理化性质进行研究。与传统的水相和有机相酶催化相比，无溶剂体系酶催化的研究较大地扩展了酶的应用范围，无溶剂体系中，酶直接作用于底物，提高了底物、产物浓度以及反应选择性[7]，纯化过程容易、步骤少，绿色环保[8]。Habib等[9]研究了无溶剂体系中，脂肪酶催化合成法与微波辅助法结合，合成油酸淀粉酯，并优化油酸淀粉酯合成的试验条件。

由于氧氧化钠/尿素混合物的水溶液能有效地破坏淀粉分子间和分子内的氧键作用力，使淀粉在低温条件下与水发生糊化反应[3]，提高淀粉的反应活性。因此，本试验选择氢氧化钠尿素混合溶液对马铃薯原淀粉进行预处理，然后以预处理淀粉和肉豆蔻酸为原料、Novozyme 435为催化剂，采用无溶剂体系酶促合成法制备取代度为0.018～0.065的肉豆蔻酸淀粉酯，并研究了其部分理化性质和结构表征。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马铃薯淀粉：甘肃薯界淀粉有限公司；Novozym 435(活力10 000 PLU/g)：诺维信(中国)投资有限公司；肉豆蔻酸：天津市光复精细化工研究所；其他试剂或药品均为分析纯；3A型分子筛：上海山浦化工有限公司；溴化钾：德州润昕实验仪器有限公司。

FTIR-650型傅里叶变换红外光谱仪：天津港东科技发展股份有限公司；DF-Ⅱ集热式加热磁力搅拌器：金坛市顺华仪器有限公司；UV-2450型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；JSM-5600LV/Kevex低真空扫描电子显微镜：日本电子光学公司；DD-5M湘仪离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；FS-400D高速分散器：北京同德创业科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 马铃薯淀粉的活化预处理

马铃薯淀粉预处理参照Lin等[10]的方法，并加以改进。将氢氧化钠和尿素按质量比2∶1(6 g∶3g )加入到100 mL去离子水中配制成混合溶液，并置于冰箱中冷却至-9 ℃，快速搅拌时加入5 g干基马铃薯淀粉，继续搅拌直至透明后，滴加稀盐酸至中性，缓慢滴加95%乙醇溶液洗涤淀粉数次至无氯离子析出，再用无水乙醇洗涤脱去水分，50 ℃干燥12 h后粉碎过筛(80 目)，得到预处理马铃薯淀粉。

1.2.2 肉豆蔻酸淀粉酯的制备

称取一定质量的肉豆蔻酸、Novozym 435、马铃薯淀粉分别置于装有3A分子筛的3个标记好的密闭容器中静置48 h，以平衡体系水分。称取16 g肉豆蔻酸置于150 mL碘量瓶中，60 ℃水浴融化后，加入4 g预处理淀粉，加入占预处理淀粉(绝干)质量的0%、1%、2%、4%的Novozym 435，在60 ℃条件下以180 r/min的转速磁力搅拌，反应期间加入一定量的3A分子筛，24 h后加入10 mL 60 ℃ 95%乙醇浸泡10 min后抽滤，用60 ℃热无水乙醇洗涤滤饼数次，恒温干燥至恒重，粉碎及过筛(80目)，密封贮藏，备用。

1.2.3 取代度的测定

参考王艳等[3]的测定方法，并略作改进。称取1.50 g烘干样品于250 mL碘量瓶中，加入25 mL蒸馏水，5 mL无水乙醇，25 mL 0.25 mol/L NaOH溶液，常温震荡60 min。取出，滴加酚酞指示剂，用0.1 mol/L HCl溶液滴定，滴至粉红色刚好消失，记录耗用盐酸的体积数V1。同时进行空白试验，记录耗用盐酸的体积数V0。肉豆蔻酸淀粉酯取代度按式(1)计算。

(1)

式中：DS为取代度；V0为滴定空白所需要的HCl量/mL；V1为滴定样品所需要的HCl量/mL；c为标准盐酸的摩尔浓度/mol/L；m为样品的质量/g；211为肉豆蔻酸酰基的分子量；162为脱水葡萄糖单元的分子量。

1.2.4 傅里叶红外光谱分析

参照Colussi等[11]的方法进行测定。

1.2.5 溶解度和膨胀度的测定

参考张燕萍[12]测定方法，并略作改进。制取质量分数为2.0%淀粉乳50 mL，于沸水浴中加热搅拌30 min，再以3 000 r/min离心20 min，取上清液，烘干至恒重，称重其质量为A，按照式(2)计算淀粉样品的溶解度；下层为膨胀淀粉部分，质量为P，按照式(3)用来计算淀粉样品的膨胀度。

(2)

(3)

式中：W为淀粉样品质量(干基计)。

1.2.6 透明度的测定

称取一定量的淀粉样品，配制质量分数为1%的淀粉乳，置于100 mL烧杯中，在沸水浴中搅拌15 min至样品完全糊化，然后自然冷却至室温，以蒸馏水做参照，用1 cm比色皿在620 nm波长处测定透光率[1]。

1.2.7 冻融稳定性测定

参考伍亚华等[13]和罗安[14]的测定方法，并略作改进。称取一定量样品，配成质量分数为3%的淀粉乳，置入沸水浴中30 min，然后冷却至室温后，取8 mL糊液倒入预先已称重(G0)的10 mL离心管中，称重G1。每个样品分别装12支离心管，置入-18 ℃冰箱24 h，取出室温自然解冻6 h。从每个样品中取出3支离心管(平行)以转速10 000 r/min离心10 min，去上清液称重G2，析水率按式(4)计算。在本研究中共进行4次冻融循环。

(4)

1.2.8 乳化性及乳化稳定性测定

乳状液的制备：参考朱波等[15]的制备方法，并略作改进。称取1.0 g样品(干基)分散于100 mL蒸馏水中，置于沸水浴中加热糊化20 min后得到均匀的乳液，冷却至室温后，于样品糊中加入25 mL大豆色拉油，用FS-400D型高速分散器以10 000 r/min的转速分散3 min，得到的乳状液加入NaN3(0.02%，m/V)作为抑菌剂。

参考朱波等[15]和孙淑苗等[16]的测定方法，并加以改进。将刚刚制备好的乳状液迅速倒入25 mL烧杯中，立即从烧杯底部5 mm处吸取乳状液50 μL于试管中，在试管中加入5 mL 0.1%的十二烷基硫酸钠水溶液(SDS)，混匀后于500 nm处测定吸光度值(A0)，静置1 h后重新取样测定吸光度值(At)，用0.1%SDS溶液做空白对照。乳化活性(emulsion ability，EA)以初始吸光值A0表示，乳化稳定性用乳化稳定指数(emulsion stability index，ESI)表示。

ESI/h=A0×Δt/ΔA

(5)

式中：A0为初始乳状液吸光值；Δt为1 h；ΔA为1 h后吸光值与A0之差。

1.2.9 疏水性测定

准确称取10 mg样品(以干基计)，置于上层为石油醚(3.0 mL)，下层为蒸馏水(3.0 mL)的混合液中进行疏水性测试[17]。

1.2.10 颗粒形貌观察

将干燥的淀粉样品充分分散于无水乙醇中，取适量涂于玻璃片上，晾干后用导电胶黏在样品座上，真空条件下在样品表面蒸镀一层10～20 mm厚的铂金膜，然后在不同放大倍数下进行电子显微镜并拍摄照片[18]。

1.2.11 数据分析

每组试验均重复3次，采用Origine 8.0、SPSS17.0等软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 制备样品取代度的测定

酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯时发现，受酶特性影响，酶添加量对酯化反应影响较大，肉豆蔻酸淀粉酯的取代度随着脂肪酶添加量的增加呈现先增大后降低的趋势(图1)。本试验中，酶添加量为2%时，淀粉酯的DS达到最大0.065，酶浓度的提高仅仅缩短了到达反应平衡的时间，当酶浓度升高到一定程度时，再增加其浓度，取代度不仅不再明显上升，反而有所下降。主要原因是脂肪酶发生团聚影响底物与酶活性中心的接触[3]。后续试验中，选择DS为0.018、0.030、0.065的肉豆蔻酸淀粉酯与原马铃薯淀粉和预处理马铃薯淀粉进行性质测定并分析比较。

图1 脂肪酶酶添加量对肉豆蔻酸淀粉酯取代度的影响

2.2 傅里叶红外光谱分析

图2 马铃薯原淀粉、预处理淀粉与肉豆蔻酸淀粉酯的红外光谱

2.3 预处理、酯化对溶解度和膨胀度的影响

试验中选择氢氧化钠和尿素混合溶液对原淀粉进行预处理，使其结晶部分受到破坏，解离了其双螺旋结构，致使游离水易于渗入淀粉分子内部，极大的促进了淀粉颗粒的溶解度[20]，因此预处理淀粉溶解度(72.46%)较原淀粉(5.14%)高很多，但预处理淀粉酯化后，其溶解度降低，并且随着淀粉酯DS的增加其溶解度显著下降(P<0.05)(从63.85%下降到39.60%)，说明脂肪酸的引入，会使淀粉的疏水性增强，且疏水性的大小与淀粉酯化程度高低(DS大小)有关。

与溶解度相反，原淀粉的膨胀度最大(36.56%)，氢氧化钠和尿素混合溶液处理使淀粉颗粒中螺旋结构破坏，膨胀度降低，肉豆蔻酸碳链的引入，使淀粉颗粒的疏水性增强，膨胀度略有增加，但不同取代度之间差异不大。

注：1：马铃薯原淀粉；2：预处理淀粉；3：肉豆蔻酸淀粉酯(DS=0.018)；4：肉豆蔻酸淀粉酯(DS=0.030)；5：肉豆蔻酸淀粉酯(DS=0.065)，余同。图3 原淀粉、预处理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的溶解度和膨胀度

2.4 预处理、酯化对透明度的影响

光线通过淀粉糊时，会产生折射、反射和散射现象，穿透淀粉糊的光线越多，表明糊的透明度越好[21]。如图4所示，预处理淀粉的透明度(81.63%)较马铃薯原淀粉(36.62%)提高2倍多，主要是由于预处理后淀粉颗粒表面及内部结构被破坏，淀粉易与水分子缔合，分散性提高了其透明度。由于酯化淀粉引入了疏水基团，阻碍了淀粉分子间及其与水分子的缔合，减弱了折射和反射强度[4]，故透明度显著下降(P<0.05)，并随着DS的增加而降低。

图4 原淀粉、预处理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的透明度

2.5 预处理、酯化对冻融稳定性的影响

反复冻融循环试验可用来评价淀粉糊的冷冻贮藏稳定性。由图5可以看出，原淀粉经过一次冻融循环后，形成海绵状结构，析水率较高，且析水率随冻融次数增加而增大，淀粉糊失去了原来的胶体性结构变成海绵状；预处理淀粉和酯化淀粉冻融稳定性较好，这主要是由于，氢氧化钠尿素处理法破坏了原淀粉颗粒结构，使更多的羟基暴露，提高了淀粉和水分子间的缔合，因此预处理淀粉的冻融稳定性高于原淀粉。而酯化淀粉由于疏水性碳链的引入，阻碍了淀粉分子间的缔合，更有益于酯化淀粉的冻融稳定性，并且随着酯化淀粉取代度的增加，冻融稳定性有较大的改善。

图5 原淀粉、预处理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的冻融稳定性

2.6 预处理、酯化对乳化性和乳化稳定性的影响

如图6所示，马铃薯原淀粉经酯化后，其乳化性和乳化稳定性均得到了较大的改善，且随着酯化淀粉取代度的增加，乳状液的乳化性和乳化稳定性显著提高(P<0.05)。当肉豆蔻酸淀粉酯的取代度为0.065时，其乳状液的乳化性较马铃薯原淀粉增加了41%左右，乳化稳定性增加了154%左右。这主要是由于，淀粉是一种亲水性高聚物，当将疏水性的中长链脂肪酸基团引入到淀粉分子链上后，淀粉便具有了一定的疏水亲油性，这就使淀粉成为一种两亲性聚合物，具有很好的表面活性[3]。但是，预处理淀粉乳状液的乳化性和乳化稳定性较原淀粉显著降低(P<0.05)，这主要是由于氢氧化钠尿素处理法破坏了原淀粉的颗粒结构，使更多的羟基暴露，提高了淀粉和水分子间的缔合，提高了淀粉亲水性的同时降低了淀粉的亲油性。

图6 原淀粉、预处理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的乳化性能

2.7 预处理、酯化对疏水性的影响

利用样品在等体积石油醚(上层)和蒸馏水(下层)中的分散量来定性分析其疏水性。由图7可以看出，原淀粉与预处理淀粉下沉至水相中，原淀粉呈现不透明状，预处理淀粉呈透明状，这与2.4中透明度结果相一致。酯化后的淀粉则分散在油相和水相之间，说明脂肪酸碳链的引入改变了淀粉的表面极性，使亲油性增加。该结果与Tupa等[17]的研究结论相一致。

图7 原淀粉、预处理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的疏水性

2.8 SEM扫描电镜分析

由图8可以看出，马铃薯原淀粉表面较光滑，颗粒大小不均匀，呈圆形或椭圆形；原淀粉经氢氧化钠尿素混合溶液处理后，氧氧化钠破坏了淀粉分子间和分子内氢键，其颗粒不能保持完整的圆形或椭圆形，表面粗糙且有破损，部分内部结构外露，该结果与王艳等[3]的研究存在差异，这主要是由于淀粉种类不同引起的。预处理淀粉经酯化后，其颗粒结构疏松且规整度差，呈现与预处理淀粉不同的形貌和结构，这说明淀粉的结晶结构在一定程度上被酯化反应所破坏，且随着肉豆蔻酸淀粉酯取代度的增加，晶体结构破损更为严重，结构更为松散。

图8 马铃薯原淀粉、预处理淀粉与肉豆蔻酸淀粉酯的SEM照片

3 结论

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Properties and Structure of Myristate Acid Starch Esters Prepared by Lipase

Bao Xuemei Niu Lili Wang Yue Zeng Zhuli Lai Xingjuan Jia Zhichun Zhang Shenggui
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070)

To improve the reactivity of starch, NaOH/urea was used to treat the potato starch and the treated potato starch and nutmeg acid were taken as raw materials. In the solvent-free system, substitution starch myristate(DS=0.018～0.065) was prepared using Novozyme 435 as catalyst, and its physicochemical characters were also studied. The results showed that compared with native potato starch, the solubility and the transparency of pretreated starch significantly increased (P<0.05), but the swelling power, freeze-thaw stability, emulsion ability and emulsion stability index significantly reduced (P<0.05). Meanwhile, comparing with native potato starch, the increase of DS, the swelling power, freeze-thaw stability and emulsion stability index increased; but the solubility, emulsion ability and transparency decreased. The pretreated starch and the myristate acid starch esters with different DS were characterized by SEM, FTIR, and the determination of hydrophobic. The results indicated that the structure of starch granule was destroyed, esterified starch had good hydrophobicity compared with the native starch, and the generation of pretreated starch and esterified starch was verified by FTIR.

enzymatic synthesis, potato starch, starch myristate, properties

甘肃省农业生物技术研究与应用开发(GNSW-2014-10)，甘肃省农业科技创新(GNCX-2012-43)

2015-09-22

包雪梅，女，1991年出生，硕士，农产品加工及贮藏工程

张盛贵，男，1970年出生，教授，淀粉深加工

S532

A

1003-0174(2017)04-0052-07