柱前衍生高效液相色谱法检测肉制品中亚硝胺化合物

洪凰++朱洪亮++葛芳芳

摘要 建立了高效液相色谱法测定了肉制品中N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）和N-亚硝基吡咯烷（NPIR）化合物的新方法。通过与脱亚硝基化试剂（HBr+HAc）作用，脱去亚硝基生成相应的二级胺，再与丹磺酰氯反应，荧光检测器（FLD）检测，保留时间定性，外标法定量。结果表明：该方法在0.1～50.0 μg/mL浓度范围内，3种化合物均具有良好的线性响应，方法对NDMA、NDEA、NPIR的检出限均为0.5、2.0、2.0 μg/kg，在不同添加水平下的平均回收率分别在86.7%～116.4%、81.0%～91.5%、82.5%～107.5%之间，相对标准偏差（RSD）均<8.9%。

关键词 柱前衍生；高效液相色谱法；亚硝胺

中图分类号 O675 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）16-0243-01

亚硝胺是对含有N-N=O化合物的一类物质的统称，其具有较强的致癌性。亚硝胺类化合物的数量很大，而且多数亚硝胺化合物的致癌性都很强。现有研究表明，已经检测到的亚硝胺类化合物种类有300多种，有270种以上能够诱导至少1种动物癌症。食品中发现的亚硝胺主要为N-二甲基亚硝胺、N-二乙基亚硝胺、亚硝胺吡咯烷等。

目前，针对《食品中N-亚硝胺的检测标准（GB/T5009.26-2003）》中规定的标准检测方法为气相色谱-热能分析仪法和气相色谱-高分辨率质谱法。但气相色谱-热能分析仪法需要专用的热能检测器，高分辨率质谱仪价格昂贵，一般检测实验室较少配备。液相色谱法检测食品中亚硝胺虽有报道[1-2]，但由于在紫外光的照射下会发生分解，造成检测结果的偏差。但液相色谱具有价格低廉、操作简便的优点，国内各级实验室都配备。在实际检测过程中，寻找一种应用高效液相色谱法测定食品中亚硝胺污染物的方法十分必要。本文通过丹磺酰氯衍生反应改变N-亚硝胺的结构，提高液相色谱对 N-亚硝胺的选择性和灵敏度，建立了一套基于柱前衍生高效液相色谱测定肉制品中种亚硝胺的新方法，方法简单，适用性强，解决了各级食品检测实验室由于检测设备的限制而无法对这一类食品中的重要污染物进行监测的难题。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪，配荧光检测器。

标准储备溶液的配制：准确称取适量N-二甲基亚硝胺（NDMA）、N-二乙基亚硝胺（NDEA）、亚硝胺吡咯烷（NPIR）标准品0.100 0 g于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀释定容至刻度，4 ℃冰箱中保存备用。

丹磺酰氯衍生试剂的配制：称取丹磺酰氯试剂1.00 g，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶中。

脱亚硝基化试剂的配制：准确移取48% HBrO3 1.0 mL到10 mL容量瓶中，加冰醋酸稀释到刻度。

二氯甲烷、乙腈、正己烷均为色谱纯；其他试剂均为分析纯，试验用水为超纯水。

SPE柱的预处理：在6 mL SPE柱中装填Ambersorb 572填料1 500 mg，填料上下各垫一层玻璃棉，依次用正己烷10 mL、二氯甲烷10 mL淋洗，抽干残留溶剂后再用纯水10 mL润洗，备用。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：ODS-2 Hypersil C18柱（200×4.6 mm，5μm）；柱温30 ℃；进样体积50 μL；流速1.0 mL/min；流动相为乙腈-水（55∶45）；检测波长：激发波长350 nm，发生波长530 nm。

1.3 试验方法

称取粉碎的样品200.0 g于500 mL水蒸气蒸馏装置的蒸馏烧瓶中，加入水100 mL及氯化钠120 g，充分振摇使氯化钠完全溶解，连接蒸馏装置，收集馏出液400 mL。馏出液过SPE柱，保持流速为6 mL/min[3]。

572柱萃取完成后，35 kPa负压下抽干去除残余水分， 用二氯甲烷7 mL将亚硝胺化合物洗脱下来。将洗脱液再过无水硫酸钠柱脱水后，用氮吹仪于40 ℃下浓缩至约100 μL。将上述浓缩液转移到1.5 mL反应瓶中， 加入脱亚硝基化试剂20 μL，密封后置于100 ℃控温箱中进行脱亚硝基化反应10 min。冷却至室温后，加入2 mol/L氫氧化钠溶液100 μL，使之呈碱性，然后加入饱和碳酸氢钠溶液300 μL进行缓冲，再加入丹酰氯溶液100 μL，盖塞混匀后，于40 ℃恒温水浴振荡器内避光反应45 min。反应完毕后，用乙腈定容至5 mL，振荡混匀后，取适量溶液，用0.45 μm有机滤膜过滤后待测。同时做空白试验。

2 结果与分析

2.1 脱亚硝基化反应

要将N-亚硝胺化合物结构中的N-NO键断开，需要脱亚硝基试剂（氢溴酸和冰醋酸的混合物），反应发生后，会产生相应的二级胺和NO自由基。根据文献[3]报道，在100 ℃下反应10 min可得到满意的结果，因此试验选取100 ℃和10 min作为脱亚硝基化反应的温度和时间。

2.2 衍生反应条件的优化

不同的衍生化反应物和反应条件对衍生化反应具有重要的影响。将N-二乙基亚硝胺的脱亚硝基化产物、二乙胺（DMA）应用在试验中，确定另一种反应物为丹磺酰氯，在不同的反应条件下进行试验，从而确定衍生化反应的条件。

2.2.1 反应温度的选择。为了明确反应温度对试验效果的影响，进行了不同温度下的衍生化反应试验。试验设置的温度为20、30、40、60、80 ℃，反应物为二乙胺与丹磺酰氯，结果发现适当提高温度有利于提高衍生化反应的进行，反应在 40 ℃时衍生物含量最大，继续升高温度对衍生物的生成量影响不大，甚至反而下降，这可能是由于温度过高导致其他副反应的产生，故选择40 ℃作为最佳反应温度。

2.2.2 反应时间的选择。根据文献报道[4]，丹磺酰氯与生物多胺的反应在放置过夜或在较短时间内适当加热均能反应完全，本文固定其他条件，测定在40 ℃时，二乙胺与丹磺酰氯在20～60 min内反应产物的影响，发现在40 min后衍生化产物的生成量基本稳定，故本试验选定45 min作为反应时间。

2.2.3 pH值对衍生反应的影响。研究表明[5]，弱碱性的反应环境能够使丹磺酰氯衍生反应获得较好的效果，而溶液的酸碱性会随着N-亚硝胺脱亚硝基化反应的进行而逐渐改变，在试验结束后，溶液呈强酸性，要选择强碱对其进行中和。本试验过程中选择的强碱试剂为NaOH溶液，试剂的浓度为2 mol/L，由此来改变溶液的pH值，再加入300 μL饱和NaHCO3组成缓冲溶液，以考察溶液pH值对反应的影响，结果表明加入100 μL的2 mol/L NaOH溶液时的产率最高[6-10]。

2.3 色谱条件的优化

试验考察了乙腈-水和甲醇-水2种流动相对目标化合物的分离效果。结果表明，乙腈比甲醇的洗脱能力强，有更好的分离能力，使用甲醇作流动相时，目标化合物不仅保留时间长而且峰型较宽，试验选择乙腈和水作为流动相，当乙腈：水的比例为55∶45时，3种化合物峰型良好，且相互之间能够很好的分离。优化后的标样分离图谱见图1。

2.4 线性关系和检出限

将试验仪器按照试验设计进行设置，测定和绘制标准溶液。绘制标准曲线的过程中以浓度X（μg/L）、峰面积（Y）分别作为横纵坐标。结果表明，在0.5～50.0 μg/L浓度范围内，3种亚硝胺化合物线性关系良好，线性相关系数均达到0.995以上，检出限均在0.2 μg/kg（表1）。

2.5 方法回收率与精密度

在某腌豬肉样品中分别加入3种亚硝胺化合物混合标准溶液，使其中亚硝胺的含量分别为2.0、20.0 μg/kg，连续测定6次，计算回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表2。可以看出，回收率和相对标准偏差均能满足分析得要求。

3 结论

本文建立了通过柱前衍生以高效液相色谱荧光检测的方法分析食品中N-亚硝二甲胺、N-亚硝二乙胺、N-亚硝吡咯烷污染物的新方法，该方法的线性范围及回收率均能满足分析的要求，可用于肉制品中亚硝胺污染物的检测分析。

4 参考文献

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