响应面试验优化豌豆胰蛋白酶抑制剂超声粗提工艺

俞红恩，刘红开，康玉凡,*

（1.中国农业大学农学院，北京 100193；2.济南大学商学院，山东 济南 250002）

响应面试验优化豌豆胰蛋白酶抑制剂超声粗提工艺

俞红恩1，刘红开2，康玉凡1,*

（1.中国农业大学农学院，北京 100193；2.济南大学商学院，山东 济南 250002）

利用响应面分析法对豌豆胰蛋白酶抑制剂超声辅助粗提工艺进行优化。通过单因素试验筛选最佳单因素条件：样品颗粒度80 目、超声频率40 kHz、超声时间13 min、超声温度40 ℃、料液比1∶80（g/mL）、超声功率500 W。在单因素试验基础上，选取超声时间、超声温度、料液比、超声功率为自变量，胰蛋白酶抑制剂总活性为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理采用四因素三水平的响应面分析法，并且建立二次多项式回归方程的预测模型。根据回归模型，在超声频率40 kHz、样品颗粒度80 目的条件下，确定豌豆胰蛋白酶抑制剂总活性最高的优化组合为超声时间16 min、超声温度50 ℃、料液比1∶100（g/mL）、超声功率500 W，豌豆胰蛋白酶抑制剂总活性为574.54 TIU/g，与理论预测值582.80 TIU/g相比，其相对误差为1.42%；R2Adj=0.886 4，R2=0.943 2，说明该模型拟合程度较好，通过响应面优化后得出的回归方程具有一定的实践指导意义。

豌豆；胰蛋白酶抑制剂；提取；响应面法；超声

豌豆（Pisum sativum L.），又名毕豆、国豆、荷兰豆、麦豆等[1]，种质资源丰富、来源广、产量高、价格低，是我国重要的食用豆类之一，具有粮食、蔬菜、饲料及医药等多种用途。豌豆含有丰富的蛋白（20%～24%，高于豇豆、绿豆）、淀粉、维生素、矿物质和多种人体必需氨基酸[2]，且赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等必需氨基酸比例均衡，含量（高于蚕豆和大豆）均符合联合国粮农组织与世界卫生组织所推荐的标准模式[3]。豌豆可以加工成多种食品，如速溶豌豆粉、豌豆酱等，主要用于制作粉丝（主要成分为淀粉）；豌豆也被加工成各类休闲食品，广受欢迎。同时，豌豆品种中胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor，TI）含量也较高。Hobday等[4]研究发现在无菌环境中发芽的豌豆种子中含有能够抑制胰蛋白酶活性的蛋白成分。Howard[5]发现新西兰豌豆栽培品种中的TI有3～9 种亚型。TI结构与大豆结构相似，存在6 种亚型，分子质量为6.8～7.9 kD[6]。Clemente等[7]研究指出，TI的一种亚型能剂量依赖性地抑制人体早期结肠癌细胞HT29，这对研究TI亚基特定性功能有一定的参考价值。Wang Xiaofang等[8]报道在加拿大5 个地区种植的17 个豌豆品种中的TI活性品种间差异显著，这为在不同地区筛选优质豌豆提供指导意义。TI的传统粗提取主要是通过磁力搅拌浸提数小时后进行热变性处理、硫酸铵分级沉淀或等电点聚沉、纳滤膜超滤等方法除杂蛋白得粗提液。付煊赫[9]以正交试验法研究发现鹰嘴豆TI的最佳提取工艺为pH 4.0，提取料液比1∶40，50 ℃浸提1.5 h。梁雪华等[10]以响应面法优化大豆TI粗提工艺。然而，国内学者对TI的研究多集中于大豆、绿豆及红小豆等少数几类，对TI的研究还鲜有报道，并且TI的粗提方式主要为磁力搅拌浸提，耗时较长。

TI泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的小分子蛋白或多肽，在动植物等生命体内广泛存在，是自然界中含量最为丰富的蛋白种类之一。TI可与机体内相应的蛋白水解酶形成动态平衡体系，参与调节众多重要的生命活动[11]。植物储藏器官，如种子、果实、块茎中含有相对较多的TI。TI是一种抗营养因子[12]，能与食道中的胰蛋白酶结合从而影响营养物质的消化吸收；然而TI也是一种重要的生理活性蛋白，参与调控众多机体生理代谢活动，如降血糖[13-14]、抑癌消炎[15-16]、辐射保护[17]、抗病虫[18]等，应用前景良好。鉴于TI的双重功效，使其在医学、农业及食品科技等领域有了越来越多的应用，因此针对不同豆类TI在医学及营养学等领域的研究有着重大意义。

超声波提取法是一种优良的提取方法，因其操作简单、方便、能耗低，已经被广泛运用于天然植物的生物碱、多糖、苷类及蛋白质等有效成分的提取。超声辅助提取法主要是利用超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度、加大介质的穿透力即能够破坏植物细胞壁，使溶剂易于渗入细胞内，进而提高生物有效成分的提取效率[19]。响应面法是在试验设计的基础上，通过试验所得数据，建立数学模型来快速有效地确定多因子系统的最佳条件，由于采取了更为合理的试验设计，能以最为经济的方式对试验进行全面研究，该法已广泛地应用于食品工业、化学化工等方面的研究[20-22]，然而利用响应面法来优化超声辅助提取豌豆TI粗提工艺的研究鲜有报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆为成豌8号，收获年份2016年，来自四川农业科学研究院，旋风磨研磨，置于4 ℃冰箱中备用。

苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐（Nα-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride，BAPNA）、胰蛋白酶（酶活力大于250 NFU/mg） 美国Sigma公司；Tris、无水氯化钙、二甲基亚砜等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1093 CYCLOTEC旋风磨 瑞典Foss公司；全波长酶标仪 赛默飞世尔公司；KQ-500E型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；多管旋涡混合仪 杭州米欧仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆TI的提取

TI的提取采用超声波辅助水浸提取法。

1.3.2 豌豆TI含量的测定

TI含量的测定参照文献[23-24]进行，胰蛋白酶可催化水解BAPNA，引起410 nm波长处吸光度的增加，而TI可抑制胰蛋白酶的活性，使410 nm波长处吸光度增加的幅度有所减少，以其减少的程度表示此抑制剂的抑制能力，从而计算抑制活性。

溶液配制：Tris-HCl缓冲液：0.222 g CaCl2溶于100 mL 0.05 mol/L、pH 8.2 Tris-HCl缓冲液；BAPNA溶液（现用现配）：先以0.5 mL二甲基亚砜溶解0.02 g BAPNA，再用已预热37 ℃的Tris-HCl缓冲液定容至50 mL；胰蛋白酶溶液：0.004 g胰蛋白酶用0.001 mol/L的HCl溶液溶解并定容至50 mL；30%乙酸溶液：分别量取30 mL冰乙酸及70 mL蒸馏水，混匀。

微反应板上依次加入50 μL样品液、50 μL胰蛋白酶液，37 ℃保温10 min后，加入125 μL BAPNA溶液，37 ℃保温30 min，加入25 μL乙酸溶液终止反应。在410 nm波长处用酶标仪测定吸光度[25]。豌豆胰蛋白酶抑制活性单位定义为：在上述反应条件下能够抑制1 mg胰蛋白酶活性所需要的TI量为1个活性单位（TIU）。

1.3.3 响应面试验设计

根据单因素试验的结果，以超声时间、超声温度、料液比、超声功率设计四因素三水平响应面试验，确定成豌8号中TI最佳提取条件。响应面试验因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 豌豆TI超声粗提单因素试验结果

2.1.1 样品颗粒度选择

图1 样品颗粒度对TI总活性的影响Fig. 1 Effect of sample granularity on trypsin inhibitory activity

控制反应条件为超声频率40 kHz、超声功率300 W、超声时间10 min、超声温度40 ℃、料液比1∶100，考察以孔径为40、60、80、100 目筛网对样品进行分级过筛，并测定TI的总活性。由图1可知，随着豆粉筛网目数的增加，TI总活性也增加，当豆粉筛网目数为80目时TI总活性最大，当筛网目数大于80目时，TI总活性下降。成豌8号含油量低，粉碎过筛彻底，成豌8号过40目筛网所得样品颗粒包含了绝大部分的种皮颗粒物，因而TI总活性相对较低。因此选择豆粉颗粒度最佳为过80目筛网。

2.1.2 超声频率选择

图2 超声频率对TI总活性的影响Fig. 2 Effect of ultrasonic frequency on trypsin inhibitory activity

控制反应条件为样品过80目孔径筛网、超声功率300 W、超声时间10 min、超声温度40 ℃、料液比1∶100，考察在超声频率为20、40、80 kHz时TI总活性。由图2可知，超声频率为20 kHz和40 kHz时，豌豆TI总活性提高且存在显著差异，超声频率为40 kHz和80 kHz时，二者TI总活性不存在显著差异。因此，选择40 kHz作为最佳超声频率。

2.1.3 超声功率选择

图3 超声功率对TI总活性的影响Fig. 3 Effect of ultrasonic power on trypsin inhibitory activity

控制反应条件为样品过80目孔径筛网、超声频率40 kHz、超声时间10 min、超声温度40 ℃、料液比1∶100，考察在超声功率为200、300、400、500、600 W时提取的TI总活性。由图3可知，随着超声功率的增加，豌豆TI的总活性也升高，当超声频率达到500 W时，TI总活性达到最大；但超声功率过大反而引起TI总活性下降，说明超声功率对TI总活性的影响是双向的，既存在正效应又存在负效应。超声波在提取液中产生的空化效应和机械作用可以有效地破碎植物细胞壁，使有效成分呈游离状态并溶入提取溶剂。因此，一定功率时可促进TI的提取；当功率过高时，TI会在超声的作用下分解，同时，也会使更多的脂溶性物质溶入提取液中，影响后期TI的纯化。试验中应避免超声波功率过大而引起TI总活性的下降，同时超声功率升高会引起温度升高。因此，选择500 W作为最优超声功率。

2.1.4 超声时间选择

图4 超声时间对TI总活性的影响Fig. 4 Effect of ultrasonic radiation time on trypsin inhibitory activity

控制反应条件为样品过80目孔径筛网、超声频率40 kHz、超声功率500 W、超声温度40 ℃、料液比1∶100，考察在超声时间为5、9、13、17、21、25 min时提取的TI总活性。由图4可知，随着超声时间的延长，豌豆TI的溶出量增加。当超声时间为13 min时，TI总活性达到最大，但13 min后，超声时间的延长反而使TI总活性下降，这是因为超声时间的延长增加了超声波作用的强度，不仅破坏细胞壁，而且破坏了豌豆TI的高级结构，导致TI总活性下降[26]。粗提液中蛋白变性也可能是由于气泡的融合及气液层对蛋白分子的吸附作用[27]。因此，选择13 min作为最优超声时间。

2.1.5 超声温度选择

图5 超声温度对TI总活性的影响Fig. 5 Effect of ultrasonic temperature on trypsin inhibitory activity

控制反应条件为样品过80目孔径筛网、超声频率40 kHz、超声功率500 W、超声时间13 min、料液比1∶100，考察在常温对照（CK）和超声温度30、40、50、60、70 ℃时提取的TI总活性。由图5可知，随着超声温度的升高，使细胞壁渗透性增强，同时增加提取物的扩散系数和溶解度，降低溶剂黏度，使更多的豌豆TI溶于溶剂中，继而豌豆TI总活性逐渐升高，当超声时间升到40 ℃时，TI总活性达到最大，随着超声温度的进一步升高，TI总活性出现下降的趋势，超声的热效应使提取温度随时间的延长而逐渐上升，温度过高导致部分TI蛋白变性失活、内部的氧化还原及聚合反应，同时容易造成溶剂挥发损失及豆粉中其他成分溶解度的增大，从而影响TI总活性的测定。因此，选择40 ℃作为最优超声时间。

2.1.6 料液比选择

图6 料液比对TI总活性的影响Fig. 6 Effect of solid-to-liquid ratio on trypsin inhibitory activity

控制反应条件为样品过80目孔径筛网、超声频率40 kHz、超声功率500 W、超声时间13 min、超声温度40 ℃，考察料液比在1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140时提取的TI总活性。由图6可知，随着溶剂用量的增加，从细胞内到溶剂之间扩散的浓度梯度增大，豌豆TI浸提量增加，但溶剂用量达到一定程度时，豌豆种子中TI接近全部溶出，再增加溶剂用量反而使TI总活性下降，可能是因为豆粉中一些其他物质如多糖溶解，妨碍了TI提取分离。溶剂用量增大在一定程度上提高传质推动力，但从提取效果、减少溶剂用量、降低能耗等方面综合考虑，溶剂用量也不宜过大。当料液比为1∶80时，TI总活性达到最大，因此，选择1∶80作为最优料液比。

2.2 响应面试验结果

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

通过Design-Expert 8.0.6软件对表2的数据进行多元回归拟合，获得编码自变量超声时间（A）、超声温度（B）、料液比（C）、超声功率（D）对TI总活性（Y）的二次多项回归方程：Y=514.16-15.74A+8.94B+ 30.26C-17.76D+24.16AB+23.15AC-4.29AD+8.90BC-11.36BD+17.79CD-23.01A2-3.14B2+9.95C2-17.72D2。对该回归模型及系数进行显著性检验，结果见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

由表3可知，一次项A、C、D对结果的影响极显著（P＜0.01）；B对结果的影响显著（P＜0.05）；AB、AC、CD交互作用极显著（P＜0.01）；二次项A2、D2影响极显著（P＜0.01）；C2影响显著（P＜0.05）；失拟项不显著（P＞0.05）。模型调整确定系数R2Adj为0.886 4，说明模型能解释88.64%响应值的变化，拟合程度较好；因变量与所考察自变量之间的复相关系数R2为0.9432，说明该模型拟合程度较好[28-29]，试验误差小，可用该回归方程代替真实点对试验结果进行分析。由表3还可知，各因素对TI总活性影响程度的大小顺序为：料液比＞超声功率＞超声时间＞超声温度。

根据回归模型，得出TI总活性最高的优化组合为超声时间15.91 min、超声温度50 ℃、料液比1∶100 （g/mL）、超声功率459.14 W，TI总活性的理论最高值为582.80 TIU/g。

在回归模型方差分析结果的基础上，根据得到的回归二次方程，做超声时间、超声温度、料液比、超声功率对TI总活性影响的响应面图，分析两个因素交互作用对TI总活性的影响。从图7可看出，每组因素交互作用下，TI总活性均有最大值，说明各组交互作用对TI总活性有影响。响应面的形状可反映出各因素交互作用对TI总活性的影响，曲面越陡峭[30]，影响越显著。

图7 两因素交互作用对TI总活性的响应面图Fig. 7 Response surface plot showing the effect of operating parameters on trypsin inhibitory activity

根据Box-Behnken模型预测响应面优化的最佳工艺条件，考虑到实际操作的可行性，将豌豆TI粗提条件调整为超声时间16 min、超声温度50 ℃、料液比1∶100（g/mL）、超声功率500 W，此时TI总活性为574.54 TIU/g。该值与理论值接近，说明采用响应面法优化豌豆TI粗提工艺可行。

3 结 论

采用超声辅助提取豌豆TI，在单因素试验的基础上，通过响应面Box-Behnken试验设计，建立了TI总酶活的二次多项式数学模型。优化超声提取豌豆TI的最佳工艺条件为超声时间16 min、超声温度50 ℃、料液比1∶100 （g/mL）、超声功率500 W，在此条件下实际测定的TI总活性为574.54 TIU/g，仅与响应面理论预测值相差1.42%，说明以上数学模型对豌豆TI的粗提条件的优化具有可行性。豌豆种子中含有丰富的TI，采用响应面分析法优化超声辅助提取TI粗提工艺，较传统的磁力搅拌浸提方法大大节省了提取时间，为TI的进一步纯化与利用提供重要参考。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Trypsin Inhibitor from Pea Seeds by Response Surface Methodology

YU Hong’en1, LIU Hongkai2, KANG Yufan1,*
(1. College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2. Business School, University of Jinan, Jinan 250002, China)

The purpose of the current study was the optimization of the solvent extraction of trypsin inhibitor from pea seeds

with ultrasonic assistance. A sample granularity of 80 mesh, an ultrasonic frequency of 40 kHz, a radiation time of 13 min, an extraction temperature of 40 ℃, a solid-to-solvent ratio of 1:80 (g/mL), and an ultrasonic power of 500 W were determined to be optimal using one-factor-at-a-time method. Ultrasonic treatment time, extraction temperature, solid-to-solvent and ultrasonic power were taken as independent variables for further optimization by establishing a quadratic polynomial regression model to predict trypsin inhibitor activity using a Box-Behnken design and analyzing the model by response surface methodology. The final optimized extraction conditions were found to be 80 mesh, 40 kHz, 16 min, 50 ℃, 1:100 (g/mL) and 500 W for sample granularity, and ultrasonic frequency, ultrasonic treatment time, extraction temperature, 50 ℃and solid-to-solvent ratio, respectively. Under these conditions, the maximum trypsin inhibitor activity of 574.54 TIU/g was obtained experimentally, showing a relative error compared to the predicted value of 1.42%. The developed model exhibited an adjusted coefficient of determinationof 0.886 4 and a coefficient of determination (R2) of 0.943 2, indicating an excellent goodness of fit. The model is of great guidance significance.

pea; trypsin inhibitor; extraction; response surface methodology; ultrasonic

10.7506/spkx1002-6630-201714035

S529

A

1002-6630（2017）14-0227-06

俞红恩, 刘红开, 康玉凡. 响应面试验优化豌豆胰蛋白酶抑制剂超声粗提工艺[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 227-232.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714035. http://www.spkx.net.cn

YU Hong’en, LIU Hongkai, KANG Yufan. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of trypsin inhibitor from pea seeds by response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(14): 227-232. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201714035. http://www.spkx.net.cn

2016-09-07

国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-09-06B）

俞红恩（1992—），女，硕士研究生，研究方向为豌豆胰蛋白酶抑制剂提取纯化与特性。E-mail：15600912395@163.com

*通信作者：康玉凡（1963—），女，教授，博士，研究方向为种子生物学及豆类芽菜理论与技术。E-mail：yfkang@cau.edu.cn