祛风活血丸对EAU大鼠模型TGF-β2表达的影响

喻京生，肖霞，李维，龙辉，易妙

祛风活血丸对EAU大鼠模型TGF-β2表达的影响

喻京生1，肖霞2，李维2，龙辉2，易妙2

目的通过观察祛风活血丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠模型葡萄膜TGF-β2表达的影响，探讨祛风活血丸对EAU模型大鼠的治疗效果。方法将60只Lewis大鼠随机分为6组，分别为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、祛风活血丸低、中及高剂量组，每组10只。空白对照组不作处理，其余均予以右后足垫注射光感受器间维生素A类结合蛋白多肽片断（IRBP），建立EAU大鼠模型，造模成功后进行灌胃。空白对照组与模型对照组予以蒸馏水灌胃，祛风活血丸低、中、高剂量组分别予以不同剂量祛风活血丸灌胃，阳性对照组予以熊胆开明片灌胃。分别于灌胃后第7、14、21、28 d分批处死大鼠，取眼球做免疫组化，检测TGF-β2的表达。结果TGF-β2免疫组化：各时间点模型对照组与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.01）；祛风活血丸各组大鼠与空白对照组相比，葡萄膜TGF-β2含量明显降低，各时间点差异均有统计学意义（P<0.01），其中以中、高剂量组最为明显；低剂量组于给药后第7及21 d差异有统计学意义（P7<0.01；P21<0.05）；第14及第28 d差异无统计学意义（P>0.05）；阳性对照组于给药后各时间点差异均有统计学意义（P14,21<0.01；P7,28<0.05）。结论祛风活血丸能通过调节免疫因子TGF-β2的状态，对大鼠葡萄膜炎发挥一定程度的治疗作用。

自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型；祛风活血丸；转化生长因子β；葡萄膜炎

葡萄膜炎是一组累及葡萄膜、视网膜、玻璃体及视网膜血管的炎性病变，多发生于青壮年，易合并全身性自身免疫性疾病，常反复发作，治疗棘手，可引起一些严重并发症。本研究旨在采用具有祛风清热，养血活血作用的祛风活血丸，作用于实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型，运用相关的免疫组织化学法检测大鼠葡萄膜TGF-β2的表达，通过观察TGF-β2对免疫调节的作用，从而探讨祛风活血丸防治葡萄膜炎的机制和疗效，为其治疗葡萄膜炎提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物：取健康6~8周龄，体重150~180 g Lewis大鼠（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供）60只，雌雄各半，经检查无眼疾。实验中所有涉及到实验动物的过程，均遵循湖南省实验动物管理办法。实验动物喂养要求：（1）动物实验室环境的温度保持在22-25℃；（2）标准饲料和灭菌用水喂养，可自由饮水和饮食；（3）保持正常光照-黑暗周期，并尽量避免强光和噪音的刺激；（4）实验操作时，取放动物轻柔，小心操作。

实验药物：祛风活血丸由湖南中医药大学第一附属医院提供（批号：20140917），120 g/瓶。主要药物组成：熟地黄20 g、当归15 g、川芎6 g、柴胡10 g、黄芩10 g、杭菊花10 g、防风10 g、鱼腥草20 g。熊胆开明片（国药准字：Z19990029）：吉林长白山药业集团股份有限公司生产，产品批号：141101。

1.2 分组及给药

采用随机数字法分为6组，每组10只。分别为：空白对照组，模型对照组，阳性对照组，祛风活血丸低、中及高剂量组。空白对照组及模型对照组予以等剂量蒸馏水灌胃，每日2次，阳性对照组予以熊胆开明片成人等效剂量0.5 g/kg·d灌胃，祛风活血丸低、中、高剂量组分别予以2 g/kg·d、3 g/kg·d、4 g/kg·d灌胃。分别于灌胃后第7、14、21及28 d分批处死动物，每次每组处死2只。每组剩余的2只大鼠于第30 d以内毒素诱发复发葡萄膜炎后处死。

1.3 造模方法

以1mg IRBP粉剂与1ml PBS混合调制成浓度为1mg/ml的含IRBP的PBS溶液，放置备用。以5 ml注射器连接三通阀，分别注入0.6ml含IRBP的PBS溶液，1.4ml单纯PBS溶液，2ml完全弗氏佐剂，反复推注直到充分乳化，制成4ml混合乳剂。常规消毒后，空白对照组不作处理，其余各实验组大鼠右后足垫中部皮下进针，缓慢推注0.2ml的混合乳剂，使得每只大鼠的IRBP最终免疫量约30μg，出针并按压进针处[1]。空白组大鼠右后足垫注射等剂量无菌生理盐水。

1.4 观察指标

一般指标：每天于同一时段在裂隙灯下观察大鼠眼前节改变：如结膜充血水肿，角膜缘血管充血，虹膜血管扩张，前房渗出，晶状体前囊灰白色絮状沉着物，虹膜后粘连，瞳孔膜闭，玻璃体混浊等情况。评分标准参照Caspi临床分级进行评分[2]：0分：无炎症，视网膜红光反射正常；0.5分：虹膜血管轻度扩张、充血；1分：虹膜血管中度充血，瞳孔缩小；2分：前房轻度混浊，红光反射减弱；3分：前房中度混浊，但仍可见瞳孔，眼底红光反射暗淡；4分：前房重度混浊（积脓），瞳孔膜闭，视网膜红光反射消失，眼球前突。

采用pv-9000二步法免疫组化检测葡萄膜中TGF-β2的表达：用颈椎脱臼法处死大鼠后，用食指和大拇指捏住大鼠头部，使眼球自然突出，用眼科无齿镊夹住眼球后视神经位置，用小弯剪沿无齿镊后缘迅速剪下眼球，放入固定液内进行固定，并于2h后剪开角巩膜缘，向球内注射少许固定液固定24 h，取出放入10%甲醛溶液中72 h，脱水浸蜡，石蜡包埋后连续切片。HE染色后使用pv-9000二步法免疫组化检测试剂盒进行检测。

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0进行统计分析，采用单因素方差分析进行两两比较；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

每天于裂隙灯下观察，参照Caspi临床分级进行评分，造模第4d，临床评分为0.48±0.03；造模第5 d为0.60±0.04；第6 d为1.04±0.09；第7 d为1.90± 1.66。采用单因素方差分析，P=0.001,组间差异有统计学意义；两两比较：第4与第5 d比较，P=0.257，差异无统计学意义，其余各组相比P＜0.05,差异均有统计学意义，说明造模第5 d左右成功诱发EAU模型。

2.2 TGF-β2的表达

免疫组化法检测：各时间段空白对照组无明显TGF-β2表达，模型对照组TGF-β2表达明显增多，阳性对照组及祛风活血丸低剂量组随着时间变化TGF-β2表达轻度减少，祛风活血丸中剂量组及高剂量组随着时间变化TGF-β2表达明显减少（图1-图2）。

图1 给药后第7d光镜下大鼠葡萄膜TGF-β2的表达。①空白对照组大鼠葡萄膜TGF-β2表达较少，偶可见少量异染细胞；②模型对照组TGF-β2表达明显增多，可见强阳性棕黄色阳性物质分布，含量多，颜色较深；③阳性对照组可见强阳性棕黄色阳性物质分布，颜色较深，以边缘多见；④祛风活血丸低剂量组、⑤祛风活血丸中剂量组、⑥祛风活血丸高剂量组均可见阳性棕黄色阳性物质分布，颜色较深，分布均匀，各组差别不明显。×200

图2 给药后第28d光镜下大鼠葡萄膜TGF-β2的表达。①空白对照组大鼠葡萄膜TGF-β2表达较少，偶可见少量异染细胞；②模型对照组TGF-β2表达明显，可见棕黄色阳性物质分布，颜色稍淡；③阳性对照组可见淡黄色阳性颗粒物质分布；④祛风活血丸低剂量组可见淡黄色阳性颗粒物质分布；⑤中剂量组边缘部位可见少量淡黄色阳性颗粒物质分布，颜色较第7d时明显变淡；⑥高剂量组可见少量淡黄色阳性颗粒物质分布，颜色较第7d时变淡。×200

对免疫组化的结果进行定量分析（表1）：以平均光密度值（OD）表述被测个体单位面积内吸光物质各像素光密度的平均值，由积分光密度除以测试框内像素数目获得。OD值越大，说明测定物质的量或染色反应后颜色越深、数量越多。各组大鼠葡萄膜TGF-β2表达变化：模型组与空白组比较，葡萄膜TGF-β2含量显著上升，各时间段差异均有统计学意义（P<0.01），说明IRBP能成功诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎，并可使大鼠葡萄膜组织TGF-β2含量明显增多。各组与模型组比较：阳性对照组给药后各时间段，TGF-β2含量逐渐下降，且幅度大，各时间段差异均有统计学意义（P<0.05），其中以第14 d及第21 d下降明显（P<0.01）；祛风活血丸低剂量组在给药后第7d，TGF-β2含量显著降低（P<0.01），第21d，TGF-β2含量也有降低（P<0.05），其余时间段与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；中剂量组给药后各时间段，TGF-β2含量显著下降，差异均有统计学意义（P<0.01）；高剂量组给药后各时间段，葡萄膜TGF-β2含量显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05），特别是给药后第7、21及28d下降更明显（P<0.01）。

表1 各组大鼠葡萄膜TGF-β2光密度值（OD）分布变化¯±s）

表1 各组大鼠葡萄膜TGF-β2光密度值（OD）分布变化¯±s）

注：同时间与空白组比较，a：P<0.01。同时间与模型组比较，b：P<0.05，c：P<0.01。（单因素方差分析）

给药后时间（d）组别714 21 28空白对照组0.165±0.005 0.135±0.005 0.170±0.010 0.145±0.005模型对照组0.665±0.015 a 0.460±0.020 a 0.405±0.015 a 0.325±0.035 a阳性对照组0.605±0.015 b 0.355±0.035c 0.270±0.010 c 0.240±0.010 b祛风活血丸低剂量组0.530±0.010 c 0.440±0.020 0.350±0.010 b 0.270±0.010祛风活血丸中剂量组0.300±0.010 c 0.255±0.005 c 0.225±0.015 c 0.170±0.010 c祛风活血丸高剂量组0.375±0.015 c 0.360±0.010 b 0.270±0.020 c 0.230±0.010 c

3 讨论

在中医学上，葡萄膜炎按其发病部位及病症特点，分别属于中医“瞳神紧小”“瞳神干缺”“云雾移睛”“视瞻昏渺”“狐惑病”等范畴，其病因病机复杂，大概可分为以下几个方面：可因肝经风热或肝胆火炽，偱经上犯黄仁，或风湿热邪相摶，熏蒸黄仁；或因久病伤阴，肝肾阴亏，虚火上炎，灼伤黄仁，致使瞳神持续缩小，甚至干缺不圆；也可因痰浊上泛，或湿热蕴蒸，上攻于目；或可因肝肾阴虚，目失濡养所致。目前认为，除感染性因素外，葡萄膜炎的发病主要与免疫相关，葡萄膜在生理上具有相关的免疫学特性，是循环中免疫复合物沉积的好发部位[3]。葡萄膜富有丰富的血管和色素，分布较多的免疫活性物质，葡萄膜血管面积广，容量大，血流缓慢，容易使血流中各种免疫介质和抗原、抗体成分在此沉积，从而引发各种免疫应答反应，并呈长期反复的过程[4]。

转化生长因子-β（TGF-β）属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族蛋白，TGF-β包含多种亚型的细胞因子，主要有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，它们在结构上和功能上，对巨噬细胞、T细胞及B细胞等多种细胞产生的影响具有相似性。机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β，但是，只有在酸性环境下通过蛋白的裂解作用才可使TGF-β复合体变为活化的TGF-β。TGF-β的生物功能包括：对多种正常的和转化的细胞的增殖具有可逆性的显著抑制作用，对细胞的分化具有诱导或抑制的双重功能，可以促进细胞外基质的形成，促进伤口的愈合，抑制免疫功能等[5]。有研究发现，TGF-β在预防和治疗自身免疫性葡萄膜炎中具有重要作用[6]。炎症早期原有的潜在活性的TGF-β2及损伤部位脱颗粒释放的TGF-β2与局部暴露的细胞外基质结合而被激活，激活的TGF-β2对白细胞、单核细胞、T细胞和成纤维细胞具有很强的趋化性[7]。目前认为，维持眼的免疫抑制环境，保持前房的免疫赦免特性与TGF-β2密切相关[8]。

在本实验研究中我们发现，本次造模采用IRBP多肽合成片段，通过经大鼠右足后垫皮下注射抗原对实验动物进行主动免疫的方法，成功诱发了EAU模型。起病时间在5-7 d，症状反应剧烈，造模成功率高，在造模第5 d左右大部分大鼠出现葡萄膜炎反应。TGF-β2在造模后大鼠葡萄膜组织切片中表达较空白对照组明显增加，说明TGF-β2与免疫反应具有一定的相关性，其表现规律为在炎症高峰期表达最多，炎症消退期逐渐减少，它对白细胞等炎性细胞具有很强的趋化性，这可能与其在酸性环境下被激活，通过抑制淋巴因子和其他剌激淋巴细胞功能的因子的分化，抑制免疫活性细胞的增殖等方式达到免疫调节功能相关。低剂量组在给药后第7及21d与模型组对比，葡萄膜中TGF-β2含量下降，差异有统计学意义，在给药后第14及28 d时与模型组对比低剂量组TGF-β2降低幅度不明显，差异无统计学意义，而中、高剂量组各时间段与模型组比较差异均有统计学意义，这说明祛风活血丸治疗有效，但疗效与药物剂量有关，而如何找到最佳治疗剂量还需要更进一步研究。本研究结果证实在EAU大鼠模型中TGF-β2呈高表达，有研究表明，TGF-β因子对细胞增殖、分化和免疫功能均有显著的调节作用，它可抑制免疫效应细胞的增殖，抑制免疫效应细胞的分化和活性，抑制细胞因子的产生及其免疫调节作用[9]，我们推断IRBP诱导的EAU大鼠模型出现的免疫反应紊乱可能是葡萄膜炎发生发展的一个重要因素，因此如何重建正常的免疫系统将可能为人类治疗葡萄膜炎及预防其复发提供一种新的治疗思路。

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OBJECTIVE To explore the treatmentmechanism ofQufeng Huoxue pillon experimentalautoimmune uveitis（EAU）ratsmodel by observing the influence of the pill on TGF-beta 2 expression in themodel. METHODS Sixty Lewis ratswere randomly divided into blank control group,model control group,positive control group,low dose of Qufeng Huoxue pill group,middle dose of Qufeng Huoxue pill group and high dose of Qufeng Huoxue pillgroup,whichmeant10 in each group.Rats in blank controlgroup were not intervened,while subjects in other groupswere injected with interphotoreceptor retinoid-binding protein in right rear foot pad to establish EAU model.After thatprocedure,the blank controlgroup andmodelcontrolgroup were administrated with distilled water, meantime,Qufeng Huoxue pillgroupswere treated with differentdosesofQufeng Huoxue pill respectively by gavage. The ratsweresacrificed inbatch7,14,21,28daysafter treatmentfortheireyeballstodetecttheexpressionofTGF-beta2 by immunohistochemicalprocess.RESULTSComparison of TGF-beta 2 between blank controlgroup andmodel controlgroup showed statistical significance atevery time point（P<0.01）;In contrast to blank controlgroup,TGF-beta 2 ofQufeng Huoxue pillgroupswere lower regardlessof the time point（P<0.01）,especiallywas themiddle and high dose groups.The ratuveitiswere decreased obviously after treatment,withmedium and high dose groupsweremost obviously,each time all have significantly statistical differences（P<0.01）;The Low dose group after treatmenthas significantly statisticaldifferencesatday 7（P<0.01）;ithasstatistically significantatday 21（P<0.05）;Positive controlgroup showed significantly statisticaldifferencesatday 14 and 21（P<0.01）;ithasstatistically significantatday7 and 28（P<0.05）. CONCLUSIONS The Qufeng Huoxue pill showed obviouseffects on ratsuveitis through regulating expression of the TGF-beta 2.

experimental autoimmune uveitis ratmodel; Qufeng Huoxue pill;TGF-beta2;uveitis

R773;R285.5

A

1002-4379（2017）03-0146-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.03.002

国家自然科学基金（81273808）湖南省科技计划项目（2012SK3136）

1湖南中医药大学第一附属医院，长沙410007 2湖南中医药大学，长沙410208

喻京生，yujingsheng-mike@163.com

Influence of Qufeng Huoxue pill on TGF-beta 2 expression in experimental autoimmune uveitis rat model

YU Jingsheng1,XIAOXia 2,LIWei2,et,al.

1.The FirstHospitalofHunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208,China;2.Hunan University ofChineseMedicine,Changsha,410208,China