响应面法优化纤维素酶提取猫爪草多糖的工艺研究

廖启元，王晓阁，刘东平，刘丽敏，经嘉

（安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖241000）

响应面法优化纤维素酶提取猫爪草多糖的工艺研究

廖启元，王晓阁，刘东平，刘丽敏，经嘉

（安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖241000）

利用响应面法优化纤维素酶提取猫爪草多糖的工艺，在单因素试验基础上，以猫爪草多糖得率为考察指标，釆用三因素三水平响应面法对酶用量、pH、酶解温度三个因素进行优化.最优工艺为：酶用量0.57%、pH4.9、酶解温度49.3℃、酶解时间120 min、料液比1：20，猫爪草多糖实际得率为5.86%.

猫爪草；多糖；纤维素酶；响应面法

猫爪草（Radix Ranunculi Ternati）为毛莨科植物小毛莨（Ranunculus Ternatus Thunb）的块根，1977年开始收载于《中华人民共和国药典》.猫爪草甘、辛、温，入肝、肺经，有清热解毒、散结消肿之功效[1].现代药理与临床研究证实，猫爪草具有抗肿瘤、抗菌、调免疫抗氧化等作用[2-5]，活性部位筛选试验表明多糖是其最重要活性成分之一[6].目前，已有热水浸提、超声、微波辅助提取猫爪草多糖文献报道，但此类方法均提取温度高、能耗大，易导致多糖降解而改变其结构与活性.酶法提取通过酶解作用破坏植物细胞壁，促使胞内多糖等有效成分充分释放，提取率高，且操作条件温和、能耗低，利于工业化应用[7].本研究利用纤维素酶提取猫爪草多糖，并通过单因素试验和响应面法优化提取工艺.

1 仪器与材料

1.1 仪器

Cary 60紫外可见分光光度计（美国安捷伦），DV215CD精密电子天平（美国Ohaus公司）；HH-4恒温水浴锅（金坛市晶玻实验仪器厂）；101-1A鼓风干燥箱（金坛市天竟实验仪器厂）；S400智能型酸度计（梅特勒-托利多）；1-14台式离心机（德国Sigma公司）.

1.2 材料

猫爪草购于安徽亳州中药材市场，经安徽中医药高等专科学校汪荣斌教授鉴定为毛莨科植物小毛莨的块根，经粉碎、脱脂和干燥处理后备用；葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院）；纤维素酶（无锡市雪梅酶制剂科技有限公司）；苯酚、硫酸等试剂均为国产分析纯.

2 方法与结果

2.1 工艺流程

猫爪草→配液→酶解→离心→浓缩→醇沉→过滤→粗多糖→复溶.

2.2 猫爪草多糖含量测定采用苯酚-硫酸法测定猫爪草多糖含量[8-9].

式1中，M1为测得多糖质量，M2为猫爪草药材质量.

2.3 酶解提取条件单因素考察

2.3.1 酶用量对猫爪草多糖得率的影响

准确称取猫爪草脱脂粉末2.0 g，设置纤维素酶用量分别为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，其他因素固定于缓冲液pH5.0、酶解温度50℃、时间120 min、料液比1：30，进行酶解提取多糖.酶解后迅速加热至90℃灭酶活10 min.按工艺流程测定猫爪草多糖含量，计算多糖得率，如图1.

图1 酶用量对猫爪草多糖得率的影响

由图1可知，当纤维素酶用量从0.3%增加到0.6%时，多糖得率迅速从3.01%提高至5.60%，但此后基本保持不变.可能原因是当纤维素酶用量达到0.6%时，药材中大部分细胞壁受到酶解破坏，多糖已充分释放.此后虽继续增加酶量，但多糖得率不会继续提高.故选择纤维素酶用量为0.6%.

2.3.2 pH对猫爪草多糖得率的影响

准确称取猫爪草脱脂粉末2.0 g，设置酶解缓冲液pH分别为pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，其他因素固定于酶用量0.6%、酶解温度50℃、时间120 min、料液比1：30，进行酶解提取多糖.酶解后迅速加热至90℃灭酶活10 min.按工艺流程测定猫爪草多糖含量，计算多糖得率，如图2.

图2 pH对猫爪草多糖得率的影响

由图2可知，当pH值从3.5升高到5.0时，多糖得率从3.93%逐渐提高到5.63%，此后随pH的继续升高而降低.酶是具有高度活性的生物催化剂，其活性与稳定性均与溶液pH的密切相关，可能原因是pH影响酶的活性中心必须基团的解离状态及酶的溶解程度.pH5. 0时纤维素酶的活性与稳定性最优，故选择酶解pH值为5.0.

2.3.3 酶解温度对猫爪草多糖得率的影响

准确称取猫爪草脱脂粉末2.0 g，设置酶解温度分别为35、40、45、50、55、60℃，其他因素与“2.3.2”方法相同.计算多糖得率，如图3.

图3 酶解温度对猫爪草多糖得率的影响

由图3可知，当温度从35℃升高到50℃时，多糖得率从4.01%逐渐提高到5.65%，此后则随温度的继续升高而降低.温度对酶促反应的影响存在两面性，当初始温度较低时，随着温度逐渐升高，活化分子数量亦逐渐增加，酶反应速度加快，此时多糖得率提高；当温度过度升高后，酶受高温影响逐渐变形失活，酶反应速度降低，多糖得率随之降低.故选择酶解温度为50℃.

2.3.4 酶解时间对猫爪草多糖得率的影响

准确称取猫爪草脱脂粉末2.0 g，设置酶解时间分别为30、60、90、120、150、180 min，其他因素与“2.3.2”方法相同.结果见图4.

图4 酶解时间对猫爪草多糖得率的影响

由图4可知，随着酶解时间的增加，多糖得率也逐渐增加.当酶解时间达120 min时，多糖得率已趋于稳定，可见此时药材细胞壁中的纤维素已酶解完全，多糖得到充分释放.故选择酶解时间为120 min.

2.3.5 料液比对猫爪草多糖得率的影响

准确称取猫爪草脱脂粉末2.0 g，设置料液比分别为1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60，其他因素与“2.3.2”方法相同.结果见图5.

图5 料液比对猫爪草多糖得率的影响

由图5可知，随着料液比的增加，多糖得率也逐渐增加.当料液比达1：20时，多糖得率已趋于相对稳定，料液比过高将导致底物浓度降低，酶反应速速相应减慢，使多糖得率稍有减少.故选择料液比为1：20.

2.4 响应面法优化纤维素酶提取工艺

在上述单因素试验结果基础上，选择对多糖得率有较大影响的因素酶用量、缓冲液pH、酶解温度为自变量，以多糖得率为响应值（设置酶解时间120 min、料液比1：20），利用Minitab软件进行Box-Behnken响应面试验设计优化提取工艺.因素与水平安排见表1，试验结果与方差分析见表2与表3.

使用Minitab软件对表2的试验数据进行回归分析，得回归方程式2，方差分析与回归方程及系数显著性检验结果见表3与表4.

Y＝5.78716+0.17103A-0.08514B-0.05701C

由表3可知，回归方程极显著（P<0.01），而失拟不显著（P>0.05），表明该方程拟合度良好，无需调整，可以利用其对纤维素酶提取猫爪草多糖工艺进行分析.由表4可知，仅因素A、B2对酶解提取多糖有极显著影响.由于因素已经标准化编码，故其数值的绝对值可反映影响大小，所以各因素对多糖提取率影响大小的顺序为：酶用量>pH>酶解温度.通过响应面三维曲面图6-8可直观地反映各因素的交互作用对多糖得率的影响，Minitab软件对回归方程式2进行最优值计算，确定最优工艺参数为：酶用量0.57%、缓冲液pH4.9、酶解温度49.3℃，结合酶解提取时间120 min、料液比1：20，此条件下猫爪草多糖理论得率为5.86%.

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平

表2 Box-Behnken试验设计方案与结果

图6 酶用量与pH对多糖得率影响的响应曲面图

表3 方差分析

表4 回归方程系数显著性检验

图7 酶用量与温度对多糖得率影响的响应曲面图

2.5 验证试验

准确称取3份猫爪草脱脂粉末各2.0 g，设置酶解时间120 min、料液比1：20，按最优工艺条件：酶用量0.57%、pH4.9、酶解温度49.3℃进行纤维素酶解提取多糖，并与不加酶组进行对照，结果如表5所示.

图8 pH与温度对多糖得率影响的响应曲面图

表5 验证与对比试验结果

由表5可知，三次最优工艺提取猫爪草多糖得率的平均值与回归方程的理论预测值基本一致，且明显高于不加酶直接水提对照组的多糖得率.表明Box-Behnken设计响应面优化得到的纤维素酶提取猫爪草多糖工艺条件准确可靠.

3 结论与讨论

植物多糖的提取方法有传统热水浸提法、稀酸浸提法、超声提取法、微波提取法等[10-11]，但均耗能大，且提取条件恶劣，极易影响目标物质的结构与活性[12].酶法提取通过酶解作用破坏植物细胞而使胞内物质释放，但也使得可溶性杂质溶出增加，为后期分离精制带来困难，且还需考虑酶的回收再利用.

实验采用纤维素酶酶解提取猫爪草多糖，研究了酶用量、pH、提取温度、时间、料液比对多糖得率的影响，并通过响应面法试验设计得到最优提取工艺：酶用量0.57%、pH4.9、温度49.3℃、酶解时间120 min、料液比1：20，猫爪草多糖实际得率为5.86%.此法条件温和，能耗低，工艺稳定，下一步可研究与其他提取法所得多糖的结构及活性对比，进一步探讨酶法提取多糖的特点.

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Optimization of Cellulase Extraction Process for Radix Ranunculi Ternati Polysaccharide by Response surface methodology

LIAO Qi-yuan，WANG Xiao-ge，LIU Dong-ping，LIU Li-min，JING Jia
（Anhui College of Traditional Chinese Medicine，Wuhu，Anhui 241000）

To optimize the cellulase extraction process for Radix Ranunculi Ternati polysaccharide by Response surface methodology（RSM）.With the extraction rate of polysaccharide as the index，RSM with three factors and three levels was used to optimize the extraction process based on the results of single factor tests.The optimum extraction conditions were as follows：the amount of cellulase was 0.57%，hydrolysis temperature was 49.3℃，solvent to solid ratio was 1：20，the extraction time was 120 min under pH 4.9，the polysaccharide yield was 5.86%.

Radix Ranunculi Ternati；polysaccharide；cellulase；response surface methodology

R91

A

1671－9743（2017）05－0067－04

2016-12-07

安徽省教育厅重点项目“猫爪草多糖的提取分离及抗炎作用研究”（KJ2016A420）.

廖启元，1979年生，男，湖北武汉人，讲师，研究方向：药学.