“动物遗传学实验”教学中分子遗传实验设计举例

李荣妮, 王 勤, 李新海, 邓学梅, 吴常信

(中国农业大学 动物科学与技术学院, 北京 100193)

“动物遗传学实验”教学中分子遗传实验设计举例

李荣妮, 王 勤, 李新海, 邓学梅, 吴常信

(中国农业大学 动物科学与技术学院, 北京 100193)

利用实验室保存的果蝇特定突变品系,设计了从基因组的提取到基因分型的系列实验教学。针对果蝇体色突变的2个基因,建立基因扩增、酶切、凝胶检测方法,判定2个体色突变的基因型,利用基因型回推被检果蝇的亲本组合。实验对学生进行分子遗传实验技术的基本训练,同时,让学生从分子层面理解等位基因相互作用和基因间的相互作用关系,并加深学生对表型选择与基因型选择的差别的理解。

动物遗传学实验； DNA提取； PCR-RFLP； 基因型判定； 亲本分析

果蝇是经典模式动物,在遗传学研究中具有重要意义。摩尔根以果蝇为实验材料,揭示了著名的连锁遗传规律,并根据研究结果创立了基因论[1]。“动物遗传学实验”教学中也使用果蝇作为实验材料,对大学生进行遗传学实验技术的训练和遗传学理论的实践。畜牧业中通过基因检测促进育种发展的实例很多,如鸡绿壳蛋基因检测[2]、鸡矮小基因(dw)检测[3]均提高了纯系选育的速度,猪氟烷敏感基因检测[4]加快了疾病净化的进程。教学中通过分子手段检测动物基因型,让学生实际领会分子标记在动物育种和疾病检测方面有重要作用。实验教学中也有畜禽功能基因检测的备选实验,但是,在实际采样过程中,样品的收集经常会遇到困难,比如,猪氟烷敏感基因检测虽然实践意义很大,但是,随着这一疾病的净化,携带致病基因的猪越来越少,不能满足常年教学的需要。用果蝇筛选克隆突变基因,建立突变品系,可以长期保留实验材料,并可通过杂交创立各种基因型的组合,非常适合教学的需要。因此,在本实验室保存的果蝇黑檀体突变(e4)和黄体突变(y1)基础上,建立了2个突变品系,在教学中将2个突变品系与不同的品系进行杂交,产生不同基因型的后代,这些杂交后代就成为了实验教学的素材。

1 实验原理和实验教学材料准备

1.1 实验教学设计原理和思路

实验选择2种体色突变的果蝇——黑檀体e4和黄体y1为教学实验材料。经鉴定,e4是由于位于3号染色体上的黑檀体基因外显子1缺失448bp碱基造成的突变[5],该突变导致黑色素大量合成,使果蝇外表呈现黑檀体色[6-8]；y1是由于位于X染色体上的黄体基因起始密码子ATG突变为CTG[9],而导致黑色素不能正常合成,突变呈浅黄色[6,10]。

根据e4突变位点特征设计了合适引物,进行PCR扩增,经凝胶检测后,e4纯合个体可得到174bp产物,而正常野生型可得到622bp产物,杂合体可得到2个产物174bp和622bp。因而可直接从凝胶电泳条带区分e4纯合体、杂合体和野生型,其凝胶电泳结果见图1。

图1 黑檀体(e4)、野生型及其杂合子电泳图

根据y1突变特征设计引物,经PCR扩增可得到含突变点的396bp片段,在突变点有Alw44Ⅰ限制性内切酶识别位点,可被酶切成300bp和96bp2个片段,野生型因无酶切识别位点而不能被切开,仍为396bp,而杂合子产物经酶切后一条片段可被切开,另一条不能切开,从而呈现3条带396bp、300bp和96bp,进而可根据凝胶电泳条带判别y1纯合子、杂合子和野生型。其凝胶电泳结果见图2。

图2 黄体(y1)、野生型及其杂合子电泳图

经过杂交,可获得黑檀体杂合子、黄体杂合子,结合纯合子和野生型等各种基因型组合,对学生进行分组,引导学生检测果蝇的基因型,根据基因型、表型和性别等特征在几种可能的杂交组合中推断其亲本的来源。培养和锻炼学生的实验操作和理论推导能力。

1.2 实验教学材料——果蝇品系的准备

取y1♂与e4♀杂交,则F1♂外表为黄体,基因型(+e;y-)标记为A；F1♀外表为野生型,基因型(+e;y+),标记为B。正常野生型++♀,基因型为(++;++),标记为C；y1♂,基因型为(++; y-),标记为D；e4♀基因型为(ee; ++),标记为E。整个实验材料经组合分为3组：A和D为第一组,2种果蝇外表完全相同,基因型不同；B和C为第二组，2种果蝇外表完全相同,基因型也不同；B和E为第三组,2种果蝇外表不相同,基因型也不同。学生2人为一组,可从上面3组果蝇中随机选择一组,每人分别检测其中一种果蝇。

其中y1、e4和++,3个品系均由我校动物科学与技术学院动物遗传资源与分子育种实验室的果蝇保种室长期保存。

1.3 试剂和仪器准备

本实验教学采用无机试剂高盐法提取果蝇基因组DNA[11]。实验前需配置试剂如下[12]：

(1) BufferA: 100 mM(mmol/L)Tris-Cl(ph7.5)(溶于水后用HCl调pH值)、100 mM EDTA、100 mM NaCl、0.5% SDS,混合后室温保存；

(2) BufferB:200 ml 5 M乙酸钾、500 ml 6 M 氯化锂,混合后4 ℃保存；

(3) 异丙醇；

(4) 70%乙醇；

(5) ddH2O。

PCR扩增需要试剂为2×Taq PCR Mix,酶切需要Alw44Ⅰ限制性内切酶。

所需仪器为干式恒温器、漩涡混匀仪、离心机、PCR仪、电子天平、凝胶和成像系列仪器、移液器、PCR管等。

以上果蝇材料和试剂均需实验教学课前准备充足。

2 实验教学流程和步骤

教学实验时,学生2人为一组,随机从上面所准备的3组果蝇中取一组,每组果蝇有2种,每种5只。2人共同观察所取果蝇的表型和性别,每人分别检测其中一种的e4和y1基因型。检测流程为：提取基因组DNA→凝胶检测基因组质量→e4基因片段和y1基因片段扩增→凝胶检测PCR产物→酶切y1的PCR产物→凝胶检测酶切结果→胶图分析出果蝇基因型→推断所得果蝇的亲本杂交方式→提交实验报告。

2.1 果蝇基因组的提取

提取果蝇DNA,需要每个学生独立操作,操作步骤如下[12]：

(1) 5只果蝇装入1.5 mL离心管中,放于冰上直接使用；

(2) 向装有果蝇的离心管中,分别加入BufferA50 μL,用烧熔闭合的1 mL枪头或者小型研磨棒捣碎,再加入BufferA150 μL；

(3) 用混合仪混合样品10 s,然后置于干式恒温器中或者水浴65 ℃ 40 min,每10 min混合摇匀；

(4) 每管加400 ul BufferB,轻轻混匀后,冰浴30 min；

(5) 室温下12 000 r/min离心15 min,吸取上清液约350 ul于另一组新的已标号的1.5 ml离心管中；如需要可重复操作12 000 rpm离心和吸取上清液；

(6) 每管各加300 ul异丙醇充分混匀,室温下12 000 r/min离心15 min；

(7) 弃上清,70%乙醇洗涤沉淀,室温下风干1 min；

(8) 风干后的样品加入25 μL ddH2O溶解(用枪头反复吹打数次)；

(9) 溶解完全后放入-20 ℃冰箱中保存备用。

2.2 目的片段的扩增和酶切

e4片段和y1片段PCR反应体系相同,但引物不同。e4片段所用引物为：上游引物5’-TATCCACCACCGAACTGTAT-3’,下游引物5’-GGGCACATTATCGTACAA-3’； y1片段所用引物为：上游引物5’-TGATTACCCGAACACTGAAC-3’,下游引物5’-TCGCTCCTGAAGTTTGTAAG-3’。其反应体系如表1,其中模板DNA是上面所提取的果蝇基因组DNA。

表1 PCR反应体系

这一步操作可分组进行,选择4人一组,每人分别计算4人所需PCR体系成分加入量,从中选2人配制4人所需PCR预混体系,1人配制e4体系,1人配制 y1体系,另2人仔细观察以防配制过程出错。最后每人分别移取自己所需PCR体系量19 ul后,分别加入自己所提取得果蝇DNA模板1 ul,混匀。全班一起进行PCR扩增,程序如表2和表3。

表2 e4片段PCR反应程序

表3 y1片段PCR反应程序

PCR完成后,每个学生可直接取y1片段PCR产物进行酶切,酶切体系如表4。体系的配置也可分组进行,计算好所需配制总量,每组选一人配制,大家一起观察,以防配制出错。最后每人分别移取自己所需酶切体系量5 ul后,分别加入自己上一步所得的y1片段PCR产物10 ul,混匀。将混匀好的酶切PCR体系放于恒温37 ℃反应4 h即可。

表4 y1片段PCR酶切体系

2.3 凝胶检测

基因组DNA凝胶检测和PCR产物凝胶检测需要凝胶浓度1%,电压120 V,25 min即可,而酶切产物需要2%,电压120 V,25 min,经凝胶成像系统操作可以得到胶图。黑檀体不同基因型和黄体不同基因型胶图见图1和图2。

可8人一组,选3人进行琼脂糖凝胶配制,其他人计算所需琼脂糖量和TBE缓冲液量,并仔细观察操作是否正确。凝胶配制好后,每个人分别有序地将自己上一步所得PCR产物及酶切产物加入胶孔中,体验点样操作过程。

3 实验结果分析和提交实验报告

实验操作结束后,每个学生根据实验所得胶图分析实验结果,判断自己所提取DNA质量、PCR效果以及酶切效果,进而分析自己所得果蝇的基因型。根据同组2个人的基因型对比判断各自的果蝇来自哪种亲本杂交模式。例如,第一组(A和D),2位学生拿到的果蝇都是黄体雄蝇,若经基因型鉴定基因型是e4杂合子和y1纯合子,可推定其是y1♂与e4♀杂交所得的F1雄蝇；若基因型是e位点野生型和y位点y1纯合子,则可推定为来自y1纯繁的雄蝇。实验操作过程结束后,完成实验结果分析和亲本杂交模式分析,撰写实验报告。

4 结语

该实验包括果蝇DNA提取、PCR、酶切、电泳等实验操作,学生可以掌握单分子标记鉴定的技术过程,经过表型观察与基因型鉴定的对比,可以将实际操作的结果与遗传学理论相结合,理解基因型和表型的关系。最后学生根据基因型推断果蝇的亲本组合,使学生加深对遗传学的分子本质的理解,进而让学生领会到分子选育与表型选育的差别。因此,这一组实验是分子基本操作技术和遗传分子基础理论相结合的教学。

每年实验教学中,每个学生基本均能成功提取出果蝇基因组,成功扩增出PCR产物和得到正确酶切产物,并正确进行基因分型。通过该教学实验的训练,使学生掌握基本的生物分子技术操作,并使学生打开了通过生物分子技术来研究并验证动物遗传规律的思路,同时,也培养了学生科学的态度和团队精神,提高了其分析问题和解决问题的能力,为完成学生专业实验课程和从事科学研究实验工作打下良好基础,总体实验教学效果比较显著。

将科研工作中不同阶段的成果转化成学生简单易懂、容易操作的教学实验,要求教师在科研中注意积累教学资源,把科研的结果经过精心的再设计,才能转变成集知识性与趣味性为一体的实验教学内容[13-14]。该实验是科研成果转化为实验教学的一个案例,只需要离心机、PCR仪和电泳设备即可开展实验。实验前培育出外表相同而基因型不同的果蝇品系,是整个实验设计比较巧妙和用心之处。该实验经过多年的探索研究和实践,取得了不错的教学效果。

References)

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Example of molecular genetic experimental design in teaching of Animal Genetics Experiment

Li Rongni, Wang Qin, Li Xinhai, Deng Xuemei, Wu Changxin

(College of Animal Science and Technology,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

Based on the specific mutation lines of fruit flies preserved in the laboratory,a series of experiments from genomic extraction to genotyping are designed. Aiming at the two genes of fruit flies with the body color mutation,the methods of gene amplification,enzyme digestion and gel detection are used to determine the two genotypes of the body color mutation,and the genotype is used to push back the parent combination of the tested fruit flies. This experiment is helpful for the students to receive the basic training of the molecular genetic experimental technology,understand the interaction between alleles and gene interaction at the molecular level as well and deepen their understanding of differences between phenotypic selection and genotypic selection.

animal genetics experiment; DNA extraction; PCR-RFLP; determination of genotype； parent analysis

10.16791/j.cnki.sjg.2017.07.054

2017-01-09

2017-03-02

“动物遗传学”国家精品资源共享课项目

李荣妮(1988—),女,河南沈丘,硕士,科研教学助理,主要从事以果蝇和小型鱼为模式动物的遗传育种和教学研究

E-mail：172077851@qq.com

邓学梅(1971—),女,吉林四平,博士,教授,主要从事畜禽功能基因组研究和育种工作.

E-mail：deng@cau.edu.cn

G642.423

A

1002-4956(2017)07-0207-04