白腐真菌预处理对柳枝稷降解的影响

李 敏， 林炎丽， 杨富裕,2*

(1. 中国农业大学动物科技学院， 北京100193； 2. 国家能源非粮生物质原料研发中心， 北京100193； 3. 北京助尔生物科学研究院， 北京100085)

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)原产于北美地区，是禾本科黍属植物，也是C4植物，对水分的利用率特别高，可用于放牧、造纸、水土保持以及生态建设等[1-3]。美国首先把柳枝稷作为一种模式能源作物进行系统的研究，此后在国际上掀起了对柳枝稷的研究热潮。有研究表明，用柳枝稷生产出来的乙醇产生的能量，是柳枝稷在生产、收割和运输植物以及将其转化为乙醇等相关过程所消耗能量的5倍[4]。柳枝稷作为一种重要的能源草，欧美各国很多年前就将其作为能源植物进行研究，并大规模低成本地利用柳枝稷生产清洁能源[5]。近年来，我国对生物质能源的发展也日益重视，利用木质纤维素转化生产乙醇已经成为全球的研究热点[6-7]。而利用木质纤维素生产乙醇，必须要解决的问题就是对原料进行预处理，通过改变木质纤维素原料的结构，将木质素减少，破坏木质素和半纤维素对纤维素的包围，暴露更多的纤维素并使其更易转化为可利用的糖[8]。有研究表明，木质素的降解程度与葡萄糖和乙醇的生产率均呈现显著正相关关系，相关系数分别为0.9328和0.9270，即木质素的降解率越高，后期糖化及发酵得到的葡萄糖和乙醇就越多[9]。目前预处理方法很多(如物理法、化学法及物化结合法等)，但大多存在成本高，效率低和污染严重等问题。生物处理法因能耗低、成本低、无污染等优势成为目前研究的热点[10-11]。

本试验选取目前研究较多且对秸秆降解效果较好的3种白腐真菌即：黄孢原毛平革菌[12](Phanerochaetechrysosporium)、乳白耙菌[9](Irpexlacteus)、虫拟蜡菌[13-14](Ceriporiopsissubvermispora)及其混合真菌对柳枝稷(PanicumvirgatumL.)进行预处理，研究白腐真菌种类、预处理时间、温度、含水量和菌液量这些因素对柳枝稷木质素降解的影响，为白腐真菌对柳枝稷的生物预处理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)购买自中国工业微生物菌种保藏中心，乳白耙菌(Irpexlacteus) 购买自中国普通微生物菌种保藏中心，虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)购买自中国农业微生物菌种保藏中心，将这3株白腐真菌保存于土豆培养基并放入4°C冰箱中保存备用。

柳枝稷来源于北京涿州，自然晒干，粉碎过40目筛，放于自封袋保存，使用之前65°C烘干。原料柳枝稷的纤维素、半纤维素、酸性洗涤木质素的含量分别是36.22%, 33.74%, 8.08%。

综合PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43 g，维生素B1微量，自然pH。灭菌锅121°C灭菌15 min。

1.2 试验方法

1.2.1菌液制备 选取单一菌种菌丝长势旺盛的平板，取菌苔前端接种到液体培养基中，并在28°C恒温摇床(180 r·min-1)培养4 d，长出白色可见的菌丝球，即可作为菌液使用。混合真菌的菌液即为不同菌种的单一菌液同比例混合。

1.2.2白腐真菌拮抗试验 将活化后的白腐真菌两两对点接种到同一PDA 培养基平板上，接种点之间的距离约为3 cm，28°C恒温培养6天，每组两个重复，观察菌落的生长状况及菌丝相容情况。

1.2.3白腐真菌种类及时间对柳枝稷降解的研究 本实验总共分为7组，H表示黄孢原毛平革菌处理组；R表示乳白耙菌处理组；C表示虫拟蜡菌处理组；HR表示黄孢原毛平革菌与乳白耙菌的混合处理组；HC表示黄孢原毛平革菌与虫拟蜡菌的混合处理组；RC表示乳白耙菌与虫拟蜡菌的混合处理组；HRC表示3种白腐真菌的混合处理组。具体试验方案如下：

称取2 g烘干的柳枝稷至100 mL三角瓶中，加入5 mL蒸馏水，8层纱布封口，121°C高压灭菌15 min。冷却至室温后，在超净台工作，分别吸取7个组2 mL菌液至装有柳枝稷的三角瓶中，总共分为6批，搅拌均匀后封口放入恒温培养箱28°C下培养。分别在第5, 10, 15, 20, 25, 30 d取一批样品，过滤取样，测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)、酸性洗涤木质素(acid detergent lignin, ADL)含量。所有样品重复3次，取检测值平均值。

中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素含量的测定采用滤袋技术和范氏纤维测定法[15]。

纤维素降解率、半纤维素降解率、木质素降解率计算公式如下：

1.2.4温度、水分、菌液量对乳白耙菌降解柳枝稷的研究 采用正交试验设计法，考察温度、水分、菌液量3因子对乳白耙菌生物预处理柳枝稷的影响。称取2 g烘干的柳枝稷至100 mL三角瓶中，加入的蒸馏水设置3个浓度梯度分别为3 mL, 5 mL, 7 mL，8层纱布封口，121°C高压灭菌15 min。冷却至室温后，加入乳白耙菌菌液，且设置3个浓度梯度分别为1 mL, 2 mL, 3 mL，分别放在 20°C, 28°C, 37°C3个恒温培养箱中培养20 d，每个恒温箱有9个组，每组样品有3个重复，本次试验总共有81个三角瓶样品。在第20 d时过滤取样，测定NDF、ADF和ADL含量。所有样品重复3次，取平均值。

1.3 数据分析

利用Excel软件进行简单的数据处理和图表制作，并用SPSS 18.0中的ANOVA程序对实验结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 白腐真菌拮抗试验结果

每组两个重复，黄孢原毛平革菌(H)、乳白耙菌(R)和虫拟蜡菌(C)3个菌种在恒温箱培养至第6天的生长拮抗关系如图1所示：在第6天，黄孢原毛平革菌的粉孢子、乳白耙菌的菌丝生长迅速且浓密，虫拟蜡菌的菌丝生长缓慢，只在一小片区域生长，与其他两个菌种没有竞争优势，但3种白腐真菌两两之间均无拮抗反应，没有产生相互抑制的现象。结果表明，黄孢原毛平革菌、乳白耙菌和虫拟蜡菌两两之间可以共同培养，混合生长。

图1 白腐真菌的拮抗试验Fig.1 Antagonism test of three white rot fungi

2.2 白腐真菌种类及时间对柳枝稷降解的影响

在白腐真菌30 d的降解中，纤维素、半纤维素、木质素的相对含量发生了变化，从图2可以看出，半纤维素降解率整体呈现先升高后降低的趋势，除了黄孢原毛平革菌处理组(H)在第10天降解率达到最高值为10.8%，其他处理组都在预处理第15天达到最高降解率。在第15天，乳白耙菌处理组(R)、虫拟蜡菌处理组(C)、乳白耙菌与虫拟蜡菌的混合处理组(RC)、黄孢原毛平革菌与乳白耙菌混合处理组(HR)、3种白腐真菌的混合处理组(HRC)、黄孢原毛平革菌与虫拟蜡菌处理组(HC)的半纤维素降解率分别为18.09%, 15.04%, 14.30%, 13.76%, 12.44%, 12.08%。

图2 半纤维素降解率的变化Fig.2 The change of hemicellulose degradation rate

从图3可以看到，纤维素降解率变化上下浮动不大，变化都在±8%以内。从第20天开始，乳白耙菌处理组(R)和黄孢原毛平革菌处理组(H)的纤维素降解率一直都比其他处理组低。乳白耙菌与虫拟蜡菌的混合处理组(RC)的纤维素降解率在第30天时达到最高为5.81%，另外黄孢原毛平革菌与虫拟蜡菌的混合处理组(HC)、黄孢原毛平革菌与乳白耙菌的混合处理组(HR)、虫拟蜡菌处理组(C)、3种白腐真菌的混合处理组(HRC)在第30天的降解率分别为5.67%, 5.43%, 4.92%, 4.44%。

图3 纤维素降解率的变化Fig.3 The change of cellulose degradation rate

从图4中可以看到，乳白耙菌处理组(R)的木质素降解率变化比较明显，且在第20天时达到最高值为36.63%，黄孢原毛平革菌与乳白耙菌混合处理组(HR)木质素降解率也在第20天时达到最高值为20.17%。黄孢原毛平革菌处理组(H)、黄孢原毛平革菌与虫拟蜡菌的混合处理组(HC)、3种白腐真菌的混合处理组(HRC)在第10天的木质素降解率最高分别为31.98%, 25.99%, 15.17%, 11.52%。虫拟蜡菌处理组(C)在第5天的降解率最高为6.98%。乳白耙菌与虫拟蜡菌的混合处理组(RC)在第15天的木质素降解率最高为9.72%。总体来说，混合真菌处理组以及虫拟蜡菌处理组(C)的木质素降解率一直都不高，且在第30天时，木质素降解率变成负值。

图4 木质素降解率的变化Fig.4 The change of lignin degradation rate

2.3 温度、水分、菌液量对乳白耙菌降解柳枝稷的影响

从表5可知，当温度是28°C时，水分设置3个梯度为3 mL, 5 mL, 7 mL，乳白耙菌菌液量设置3个梯度1 mL, 2 mL, 3 mL，乳白耙菌对柳枝稷降解20 d的情况如表5：乳白耙菌对柳枝稷半纤维素、纤维素、木质素的降解会受水分、菌液量的影响。第6, 7, 8, 9这4个组的半纤维素、木质素、纤维素含量差异均不显著，而且他们的木质素含量比其他组低。第6组水分为5 mL，菌液量为3 mL时，木质素含量最少，其降解率高达63.45%，与空白组(第0组)相比差异显著(P<0.05)，半纤维素降解率为24.82%，纤维素含量和空白组差异不显著。另外，第7, 8, 9这3个组的木质素降解率分别为55.58%, 56.73%, 48.86%。

表5 温度对柳枝稷降解效果的影响Table 5 Influence of temperature on the degradation effect of the switchgrass

注：同列标有不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同

Note: Different letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level, the same as below

从表6可知，当水分为5 mL、菌液量为3 mL以及水分为7 mL、菌液量为2 mL时，乳白耙菌分别在温度为20°C, 28°C, 37°C对柳枝稷降解的情况如表6所示：在同一温度下，无论水分为5 mL、菌液量为3 mL还是水分为7 mL、菌液量为2 mL时，其半纤维素、木质素含量差异不显著，纤维素含量在20°C、28°C条件下差异也不显著；当水分、菌液量组合固定时，在20°C, 28°C, 37°C这3个温度环境条件下，纤维素含量差异不显著，但半纤维素、木质素含量都是在28°C温度条件下较低，且与其他温度条件(20°C, 37°C)相比差异显著(P<0.05)。

表6 水分、菌液量对柳枝稷降解效果的影响Table 6 Influence of water and inoculum on the degradation effect of the switchgrass

3 讨论

3.1 白腐真菌种类及时间对柳枝稷降解的分析

柳枝稷是一种重要的木质纤维作物，但其高木质素含量严重制约其作为能源植物的开发和利用[16]。在本试验，白腐真菌生物预处理柳枝稷30 d的过程中，木质素降解程度比较大，而半纤维素含量变化相对较小，纤维素含量变化不大，表明这3种白腐真菌在生物预处理过程中可以选择性地降解柳枝稷纤维组分中的木质素和半纤维素，保留及暴露更多的纤维素。这与前人研究相似，宋丽丽[9]研究了乳白粑菌玉米秸秆的预处理对纤维组分的影响，发现乳白耙菌可以选择性降解玉米秸秆中的半纤维素和木质素，在生物预处理的第28天，半纤维素和木质素分别降解了28.24%和25.46%，纤维素得到了较大程度的保留。在3种单一白腐真菌处理中，乳白耙菌(R)在第20天的木质素降解率最高为36.63%，且半纤维素降解率为17.29%，此时，纤维素降解率为负值，这可能是因为乳白耙菌对柳枝稷生物预处理前期以半纤维素、木质素为底物，因而半纤维素、木质素的含量降低了，而纤维素的含量没变化，所以纤维素的相对含量增加，从而使纤维素降解率为负值。研究表明，白腐真菌对秸秆等木质纤维素的去木质化作用是增强酶解的主要原因[17]。而本试验中黄孢原毛平革菌处理组(H)第10天的木质素降解率最高为31.98%，虫拟蜡菌处理组(C)第5天木质素降解率最高为6.98%，都低于乳白耙菌对木质素的降解率，因此，乳白耙菌对柳枝稷的生物预处理效果最好。

白腐真菌混合处理组对柳枝稷木质素的最高降解率低于乳白耙菌处理组(R)和黄孢原毛平革菌处理组(H)，但高于虫拟蜡菌处理组(C)。混合处理组对木质素降解率较低，对纤维素的降解率反而稍微高些，如乳白耙菌与虫拟蜡菌的混合处理组(RC)在第15天的木质素降解率最高为9.72%，其纤维素降解率达到5.81%，且在生物预处理后期，白腐真菌混合处理组(如HC, RC, HRC)的木质素降解率反而成为负值，即后期木质素含量反而有所增加。这与前人研究相似，Liu等[18]研究密孔菌(Pycnoporussp.)处理柳枝稷时，发现随着预处理时间延长，酸性洗涤木质素的含量呈先降低后增加的趋势，72 d后酸性洗涤木质素的含量反而超过了对照组。原因可能是在生物预处理过程中，其他成分减少，如纤维素被降解生成糖供白腐真菌自身生长利用，或者是底物浓度降低，而导致木质素相对含量增加，从而导致木质素降解率变为负值。

3.2 温度、水分、菌液量对乳白耙菌降解柳枝稷的分析

在微生物降解秸秆过程中，菌种的接种量以及培养物的气体交换是影响白腐真菌降解秸秆的重要因素[19]，培养物中的气体交换量是由秸秆与水分的相对含量之比决定。菌种接种量过大，菌体会因生长过快而对有限营养物质产生竞争活动和过多代谢产物，从而影响酶的产生；菌种接种量过小，分泌的酶量较少，导致底物过剩，从而影响预处理的效果[20-21]。水分含量过高严重降低了乳白耙菌对氧气的吸收和对二氧化碳的排出；水分含量过低时，乳白耙菌的菌丝不能很好的延长以及自身生长受到限制[22]。本试验中，在28°C下，柳枝稷被乳白耙菌降解20 d后，第6, 7, 8, 9这四组的木质素降解率较高，分别为：63.45%, 55.58%, 56.73%, 48.86%。但第6组即当水分为5 mL，菌液量为3 mL时，木质素含量最少，其降解率为63.45%，半纤维素降解率为24.82%，而且纤维素含量和空白组差异不显著。

发酵过程中的温度、时间、水分、pH及其交互作用等因素均会对发酵产生影响，对固态发酵而言，温度是首要因素[23]。合适的温度对于微生物预处理至关重要，王蕾等[24]研究温度(在37℃～ 45°C范围内)对多孔菌(Polyporusvarius)预处理芦苇的影响，结果表明，随着预处理温度的升高，木质素的降解率先升高后下降，最适预处理温度为41°C。本试验中无论水分为5 mL、菌液量为3 mL还是水分为7 mL、菌液量为2 mL，都是在28°C温度下，柳枝稷的木质素降解率最高，且与其他温度(20°C, 37°C)相比差异显著(P<0.05)。

因此，乳白耙菌对柳枝稷(2 g)进行生物预处理20 d的最适条件为：水分5 mL、菌液量为3 mL、温度为28°C，此时木质素降解率为63.45%，半纤维素降解率为24.82%，而且纤维素含量与空白组差异不显著，与优化前相比，效率提高。

4 结论

黄孢原毛平革菌、乳白耙菌、虫拟蜡菌相互之间没有拮抗反应，可以混合培养，为后续试验的混合培养提供了基础。在30 d的预处理过程中，混合真菌对柳枝稷的生物预处理与单一白腐真菌相比，并没有优势，预处理效果并不好。在单一白腐真菌中，乳白耙菌对柳枝稷的木质素降解率最高，预处理效果最好，其最佳预处理时间为20 d。