鹅呼肠孤病毒GRV-LA16株的分离鉴定

吴巧梅，李传峰，丁明洋，朱 杰，谭永贵，李 琦，刘光清，陈宗艳

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·研究论文·

鹅呼肠孤病毒GRV-LA16株的分离鉴定

吴巧梅，李传峰，丁明洋，朱 杰，谭永贵，李 琦，刘光清，陈宗艳

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

为探明安徽省某养鹅场60日龄鹅出现的软脚，排白色粪便，严重者导致鹅死亡的原因，对病死鹅进行剖检，发现其以肝脏肿大，脾脏肿大和坏死以及肺脏充血、出血为主要特征。对分离毒株进行RT-PCR扩增试验、序列分析及动物回归试验，结果表明，该分离毒株为鹅呼肠孤病毒（Goose reovirus，GRV），命名为GRV-LA16株，其ELD50为10-5.7/0.2 mL。病理组织切片结果显示，与对照组相比，肺泡壁胀破融合，毛细血管扩张出血，且肺泡腔有红色丝网状纤维素渗出物。σC基因测序结果分析表明，其与鸭呼肠孤病毒σC基因同源性为87%。GRV-LA16与鸭呼肠孤病毒亲缘关系较近，为同一拓扑群，而与经典的禽呼吸肠孤病毒（Avian orthoreoviruses，ARV）、GRV、番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）处于不同拓扑群。

鹅呼肠孤病毒；分离鉴定; σC基因

禽呼肠孤病毒（Avian orthoreoviruses，ARV）为呼肠孤病毒科（Reoviridae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）的成员之一，可感染多种禽类[1]，包括鸡、火鸡、鸵鸟、水禽、野鸭等禽类，能引起鸡的吸收障碍综合征、腱鞘炎、病毒性关节炎、矮小综合征、免疫抑制等疾病[2,3]，现已成为危害养禽业的重要疾病之一。就水禽而言，有引起鸭发病的呼肠孤病毒（Duck reovirus，DRV）[4]，引起番鸭发病的呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）[5,6]，近年也有引起鹅发病的呼肠孤病毒（Goose reovirus，GRV）报道[7]。

禽类呼肠孤病毒基因组由分节段的10个基因片段组成。其中，S1基因编码的结构蛋白为σC蛋白。σC蛋白是由326个氨基酸组成的结构蛋白，分子量大小约为35 kDa，具有高度变异性的特征，因此σC基因序列特征可以为分析不同呼肠孤病毒毒株来源提供参考依据[1,8]。

目前，在我国安徽省某鹅场的鹅出现部分死亡，其临床表现为发病鹅排白色稀粪、软脚，剖检发现肝脏出血、呈土黄色、部分发病鹅肝脏上可见黄白色坏死灶，脾脏肿大、出血、呈暗红色，肾脏肿大、出血。本研究通过对采集的病料进行病原分离与鉴定、序列分析及动物回归实验，证实病原体为鹅呼肠孤病毒。

1 材料与方法

1.1 材料 病料采集于安徽省某养鹅场；BHK-21细胞为本实验室保存；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 试剂 Tissue DNA/RNA Kit 、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion)、DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司；DMEM细胞培养液、胎牛血清购自GBICO公司。

1.3 病毒分离 将病料剪碎，按1:3体积加含有双抗的PBS溶液，匀浆器匀浆后反复冻融3次，4℃、10 000×g离心20 min，吸取上清液，0.22 μm滤膜过滤除菌。取上述滤液接种 BHK 细胞，出现病变时收集细胞液。过滤除菌的滤液同时经尿囊腔途径接种9日龄鸡胚10枚，接种量为0.2 mL/枚。接种后，置生化培养箱37℃恒温孵化，弃去24 h内死亡的鸡胚。每间隔12 h观察1次，收获死亡的胚体及尿囊液并记录结果。

1.4 病毒半数鸡胚致死量（embryo median lethal dose，ELD50）的测定 将分离株病毒悬液作10倍系列稀释，取103、104、105、106、107、108稀释度接种鸡胚，0.2 mL/个，每一稀释度接种5个鸡胚，观察记录鸡胚的死亡数，计算各稀释度的百分率。按Reed和Muench法计算病毒半数致死量（ELD50）[5]。

1.5 RT-PCR检测 按照Tissue DNA/RNA Kit说明书从细胞裂解液中提取病毒总RNA，随机引物反转录后做为模板扩增全基因。根据新型鸭呼肠孤病毒TH11株的σC基因的部分序列设计特异引物，P1：5'-ATGGATCGCAACGAGGTGATA-3'，P2：5'-CTAGCCCGTGGCGACGGTGAA-3'，其扩增长度为954 bp，引物由上海华津生物科技有限公司合成。PCR 反应体系：2×PCR TaqMix 25 μL、上游引物（50 μmol/mL）1μL、下游引物（50 μmol/ mL）1μL、cDNA 模板5μL、无菌双蒸水18 μL，总体积为50 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用AXYGEN Gel Extreaction Kit回收纯化后，将扩增的片段与pMD19-T载体连接，转化感受态细胞DH5α，挑菌落PCR 鉴定，得到含目的片段的重组阳性菌株，用于测序分析。

1.6 序列测定及分析 将阳性克隆送上海华津生物科技有限公司测序，使用DNAStar软件对测定的病毒核苷酸序列与GenBank中收录的禽源呼肠孤病毒的序列进行同源性比对和分析。

1.7 动物回归试验 取1日龄健康鹅10只，随机分为攻毒组和对照组两组，其中攻毒组7只，对照组3只。攻毒组颈部皮下注射ELD50=10-5.7/0.2 mL的病毒液0.2 mL，对照组不做处理。观察14 d，记录攻毒组发病情况，剖检观察病死鹅的大体病变，分别取攻毒组和对照组鹅的肺脏、肝脏、脾脏用4%多聚甲醛固定，按常规方法进行病理切片制作，显微镜下观察病理变化。

2 结果

2.1 病毒分离 将病料滤液感染BHK-21细胞，连续观察72 h。结果显示，盲传3代之后BHK-21细胞开始出现细胞病变（cytopathic effect，CPE）。分离病毒接种BHK-21细胞24 h后出现细胞堆聚、细胞核浓缩、胞间界限模糊；接种36 h后，细胞堆聚，部分细胞脱落，有合胞体形成（图1）；接种72 h后，大部分细胞脱落。分离得到的毒株命名为GRVLA16株。病料滤液接种9日龄鸡胚，鸡胚在36 h开始死亡，48~60 h死亡数量最多，表现为鸡胚发育不全，胚体蜷缩，体表充血、出血严重，全身弥漫针尖大小的出血点，并且胚体与正常鸡胚相比偏小（图2）。

图1 分离的病毒GRV-LA16株引起 BHK-21细胞病变Fig.1 Cytopathic effect on BHK-21 induced by GRVLA16 isolateA: 接毒36 h后的BHK-21细胞; B: 正常对照细胞A: BHK-21 cells at 36 h postinfection; B: Normal BHK-21 cells

图2 GRV-LA16株接种鸡胚后产生的病变Fig.2 Lesions of chick embryos experimentally infected with GRV-LA16 strainA: 正常胚; B: 死亡鸡胚全身出血, 并且胚体偏小A: Normal chicken embryo; B: Systemic hemorrhage in the dead embryo, which was smaller than normal one

2.2 病毒半数鸡胚致死量（ELD50） 取103、104、105、106、107、108不同稀释度的病毒悬液接种鸡胚，每个稀释度鸡胚死亡情况见表1。由此，测定的分离病毒GRV-LA16株ELD50为10-5.7/0.2 mL。

2.3 病毒分离株的RT-PCR 鉴定 利用针对σC 基因的特异性引物，以及本实验室保存的鸭病毒性肝炎、禽副粘病毒、对分离病毒GRV-LA16株进行RT-PCR检测。结果显示，特异性扩增出σC基因，其大小约为1000 bp，与预期大小相符（图3）。

表1 GRV-LA16分离株接种鸡胚死亡率Table 1 Mortality rate of chick embryo experimentally infected with GRV-LA16 strain

图3 分离株GRV-LA16的RT-PCR 鉴定Fig.3 Identif cation of GRV-LA16 strain isolated by RTPCRM: DNA分子量标准; 1: 鸭呼肠孤病毒; 2: 鸭病毒性肝炎; 3: 禽副粘病毒; 4: 禽流感病毒; 5: 阴性对照M: DNA Marker; 1: Duck reovirus; 2: Duck viral hepatitis; 3: Avian paramyxovirus; 4: Avian inf uenza; 5: Negative control

2.4 基因同源性比较和进化树分析 将获得的目的片段克隆至pMD-19T载体后进行测序，获得的核苷酸序列经BLAST发现，GRV-LA16株与其他呼肠孤病毒σC序列同源性很低，最高值仅为87%，选取NCBI中收录的参考毒株进行遗传进化树分析发现，GRV-LA16株与鸭呼肠孤病毒处于同一拓扑群，而与鸡源呼肠孤病毒、番鸭源呼肠孤病毒以及鹅源呼肠孤病毒处于不同拓扑群（图4）。

2.5 动物回归试验 攻毒组的鹅在接毒后d 3发病，接毒后6 d内死亡，其发病率和死亡率均为100%。发病鹅精神萎靡，软脚，排白色稀粪，对照组鹅无临床症状。剖检发现肝脏肿大，有小的坏死灶；脾脏肿大，呈暗红色；肾脏表面出血。病理切片结果显示攻毒组鹅部分肝小叶固有结构消失，肝细胞坏死或崩解消失，伴有炎性细胞浸润，大部分肝细胞浆内出现大小不一的空泡；肺泡壁胀破融合，毛细血管扩张出血，不可见壁，且肺泡腔有红色丝网狀纤维素渗出物（图5）。

图4 GRV-LA16株与其他参考毒株σC 核酸序列的遗传进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree based on σC gene sequences of GRV-LA16 strain and other strains

3 讨论

禽呼肠孤病毒感染水禽的报道最初仅见于番鸭，称为番鸭呼肠孤病毒病，其致病因子称为番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）[5,9]，研究表明 MDRV对我国的北京鸭以及其他地方品种鸭不具有感染性[10]。随着养鸭业的不断发展，呼肠孤病毒病感染多品种鸭也见报道，但是由于流行区域、发病种群和发病时间的不同，呼肠孤病毒感染鸭表现出不同程度的差异。程安春等[9]报道了1998年四川省、云南省等地的“鸭病毒性肿头出血症”疫情，是由鸭呼肠孤病毒所致。2009年，陈少莺等[10]报道了福建省爆发的呼肠孤病毒为新型鸭呼肠孤病毒，与以往报道的呼肠孤病毒有较大差异。随后，陈宗艳等[4,11]于2011年分离得到的TH11株也证实为新型鸭呼肠孤病毒，其发病率逐年升高、病毒致病性更强、宿主范围更广、流行的区域逐年扩大。Yun等[12]发现浙江省某地区出现的番鸭呼肠孤病毒致病性已经发生一定程度变异。2004年，王永坤[13]报道雏鹅出现一种以出血性坏死性肝炎为主要特征的疫情，后证实为雏鹅呼肠孤病毒引起。2011年，高巍等[14]报道分离的GRV-JS10株与以往出血性坏死性肝炎不同，并未造成严重的大片肝细胞坏死崩解，雏鹅以腱鞘炎和肠道后段黏膜肿块状炎症为病理特征。2013年，陈红梅等[15]也分离鉴定了11株雏鹅呼肠孤病毒FJ-06株。禽呼肠孤病毒现已成为危害水禽养殖业的重要传染病原之一，这应该引起我们的高度关注。

图5 感染GRV-LA16株鹅的肺脏、肝脏病理变化Fig.5 Pathological changes of lung, liver infected with GRV-LA16A1, B1: 正常鹅的肺脏和肝脏; A2, B2: 感染GRV-LA16株鹅的肺脏和肝脏A1, B1: Control groups; A2, B2: The lung, liver of geese infected with GRV-LA16

呼肠孤病毒为双链RNA病毒，其致病性差异主要由S1基因节段变异引起[8,14]。S1基因节段编码的σC蛋白位于病毒衣壳表面，属于黏附蛋白，能够诱导细胞凋亡，并且此蛋白具有高度变异特性，能够增强病毒感染细胞能力，是引起病毒抗原发生变异的主要原因[16,17]。σC蛋白可以特异性结合到细胞，使机体产生具有高度特异性中和抗体，激发机体粘膜和全身性免疫反应发生，诱导细胞产生合胞体，而σC特异性缺失18个氨基酸即可导致病毒致病性发生变化[8]。由于σC蛋白拥有高度变异特性[8,18]，因此可以用σC蛋白来分离鉴定不同的呼肠孤病毒毒株，比较不同毒株之间的序列差异，分析其序列差异与毒株致病力、免疫原性的关系，研究不同毒株之间的交叉保护性。

本研究病料来自安徽省某养殖场，与之前报道引起雏鹅发病不同，此株病毒能引起成年鹅软脚，导致成年鹅的死亡，剖检发现其引起鹅肝脏、脾脏部分坏死，肾脏肿大、出血。GRV-LA16株除具有DRV引起肝脾肿大、坏死的病变特征外，出现肺脏也充血、出血的特征性病变。σC基因序列的进化树分析结果表明，GRV-LA16与DRV亲缘关系较近，位于同一拓扑群；而与经典的ARV及MDRV、GRV处于不同分支。BLAST结果也表明，此株病毒的σC基因与DRVσC基因同源性相对较高，最高值为87%。郭东春等[19]报道的GRV1毒株基于σC基因序列分析发现，其与MDRV同属于一个亚群，核苷酸同源率93%，而与ARV S1133株同源率仅为21%；GRV-JS10株与ARV经典株S1133同源性为99.6%[14]；而FJ-06株部分σC基因分析表明，其与ARV同源性低，与DRV处于同一拓扑亚群[15]。本分离毒株的流行来源、流行病学意义、病毒变异与易感宿主范围扩展之间的关系以及本分离株与ARV、DRV、MDRV及GRV之间的进化关系需要进一步试验研究。

[1] Benavente J, Martínez-Costas J. Avian reovirus: structure and biology[J].Virus Res, 2007, 123(2): 105-19.

[2] Bányai K, Dandár E, Dorsey, et al. The genomic constellation of anovel avian orthoreovirus strain associated with runting-stunting syndrome in broilers[J]. Virus Genes, 2011, 42: 82-89.

[3] De Herdt P, Broeckx M, Van Driessche F, et al. Improved Performance of Broilers and Broiler Breeders Associated with an Amended Vaccination Program Against Reovirosis[J]. Avian Dis, 2016, 60(4): 841-845.

[4] 陈宗艳, 朱英奇, 王世传, 等. 一株新型鸭源呼肠孤病毒(TH11株)的分离与鉴定[J]. 中国传染病学报, 2012, 20(1): 10-15.

[5] Heffels-Redmann U, Muller H, Kaleta E F. Structural and biological characteristics of reovirues isolated from Muscovy ducks (Cairina moschata)[J]. Avian Pathol, 1992, 21: 481-491.

[6] Woźniakowski G, Samorek-Salamonowicz E, Gaweł A. Occurrence of reovirus infection in Muscovy ducks (Cairina moschata) in south western Poland[J]. Pol J Vet Sci, 2014, 17(2): 299-305.

[7] 陈红梅, 万春和, 程龙飞, 等. 一株雏鹅呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 中国动物传染病学报, 2015, 23(1): 47-50.

[8] Zheng X, Wang D, Ning K, et al. A duck reovirus variant with a unique deletion in the sigma C gene exhibiting high pathogenicity in Pekin ducklings[J]. Virus Res, 2016, 215: 37-41.

[9] 胡奇林, 陈少莺, 江斌, 等. 一种新的番鸭疫病(暂名番鸭肝白点病)病原发现[J]. 福建畜牧兽医, 2000, 22(6): 1-3.

[10] Malkinson M, Perk K, Weisman Y, Reovirus infection of young Muscovy ducks (Cairina moschata)[J]. Avian Pathol, 1981, 10(4): 433-440.

[9] 程安春, 汪铭书, 陈孝跃, 等. 一种新发现的鸭病毒性肿头出血症的研究[J]. 中国兽医科技, 2003, 33(10): 15-21.

[10] 陈少莺, 陈仕龙, 林锋强, 等. 一种新的鸭病(暂名鸭出血性坏死性肝炎)病原学研究初报[J]. 中国农学通报, 2009(16): 28-31.

[11] Chen Z Y, Zhu Y Q, Li C F, et al. Outbreak-associated Novel Duck reovirus, China, 2011[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(7): 1209-1211.

[12] Yun T, Yu B, Ni Z, et al. Genomic characteristics of a novel reovirus from Muscovy duckling in China[J]. Vet Microbiol, 2014, 168(2-4): 261-271.

[13] 王永坤. 一种新出现的雏鹅病—鹅出血性坏死性肝炎的研究[J]. 中国家禽, 2004, 26(18): 13-17.

[14] 高巍, 张建军, 庄新娟, 等. 鹅呼肠孤病毒江苏分离株的分离鉴定[J]. 中国家禽, 2011, 33(6): 62-64.

[15] 陈红梅, 万春和, 程龙飞, 等. 一株雏鹅呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 中国动物传染病报, 2015, 23(1): 47-50.

[16] Liu H J, Lee L H, Hsu H W, et al. Molecular evolution of avian reovirus: evidence for genetic diversity and reassortment of the S-class genome segments and multiple cocirculating lineages[J]. Virology, 2003, 314(1): 336-349.

[17] Grande A, Costas C, Benavente J. Subunit composition and conformational stability of the oligomeric form of theavian reovirus cell-attachment protein sigmaC[J]. J Gen Virol, 2002, 83(1): 131-139.

[18] Lin K H, Hsu A P, Shien J H, et al. Avian reovirus sigmaC enhances the mucosal and systemic immune responses elicited by antigen-conjugated lactic acid bacteria[J]. Vaccine, 2012, 30(33): 5019-5029.

[19] 郭东春, 张云, 刘明, 等. 鹅呼肠孤病毒GRV1株分离鉴定及其σC基因特征性分析[J]. 中国预防兽医学报, 2006, 28(3): 257-260.

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A NEW GOOSE REOVIRUS

WU Qiao-mei, LI Chuan-feng, DING Ming-yang, ZHU Jie, TAN Yong-gui, LI Qi, LIU Guang-qing, CHEN Zong-yan

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The aim of this study was to isolate and characterize a new Goose reovirus in Anhui province. The diseased geese were weak in legs and diarrhea. Postmortem f ndings included swollen livers and gray necrotic spots in spleens, hyperaemia and hemorrhage in lungs. By sequencing the specif c PCR product of the virus was characterized as a goose reovirus designated as GRV-LA16 strain. ELD50was titrated to be 10-5.7/0.2 mL. Histopathological examination also found that alveolar walls showed burst fusion. Moreover, the capillaries were dilated and congested, and red f brinous exudate was in the alveolar spaces. Sequencing of σC gene showed that the GRV-LA16 and novel duck reovirus had a close genetic relationship with 87% homology. Phylogenetic analysis of σC gene revealed that GRV-LA16 was not close to Avian orthoreoviruses, GRV and Muscovy duck reovirus.

Goose reovirus; isolation and identif cation; σC gene

S852.659.4

A

1674-6422（2017）03-0001-06

2017-02-07

国家自然科学基金（31502068）；国家重点研发计划（2016YFD0500800）；上海市科委科技创新（13391901602）

吴巧梅，女，硕士研究生，预防兽医学专业

陈宗艳，E-mail: zychen@shvri.ac.cn