小型猪在生殖毒性实验中的研究进展

张元慧++++++高虹

[摘要] 小型猪与人类在解剖学、生理和病理学等方面有很多相似性，具有发情周期短、仔猪数量多等优点，现已成为人类医学研究的理想动物模型，但由于背景数据缺乏、动物体型较大等原因，目前其在生殖毒性实验中并未得到广泛应用。本文根据小型猪自身的特点，对其目前在生殖毒性实验中的应用情况进行综述，旨在扩大非啮齿动物在生殖毒性实验中的选择范围，并在必要时替代犬或非人灵长类动物，为药物非临床生殖毒性试验提供新的研究思路。

[关键词] 小型猪；生殖毒性实验；研究现状；应用展望

[中图分类号] R114 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0049-04

[Abstract] As to anatomy and pathophysiology， there are lots of similarities between human and minipig. Because of its short estrus cycle and large number of piglets in a litter， minipig has become an ideal animal model for medical research in human. However， minipig has been restrictedly used in reproductive toxicity studies because of its large body size and limited background data. In this review summarizes the characteristics of minipig as well asits current applications in reproductive toxicity studies， intend to expand the range of selecting non-rodents and provide new ideas for nonclinical reproductive toxicity studies.

[Key words] Minipig； Reproductive toxicity study； Research status； Application prospect

生殖毒性是指有害因素对亲代生殖功能造成的有害作用[1]，其研究是药物非临床安全性评价的重要内容。在20世纪60年代发生的“反应停”事件造成近万名新生儿畸形，这一药物史上的悲剧促使各国加强了对生殖毒性评价的重视。生殖毒性研究对实验动物种属的选择也越来越严格，通常选用对受试物的代谢、毒效学及其他参数与人类相近的实验动物[2]。近年来，随着人们对小型猪研究的逐渐深入，其已广泛应用于医学研究[3]。已有证据显示，小型猪对很多化學物质敏感，对某些特殊药物的反应性比传统的非啮齿类动物可能更具有优势[4]。本文针对小型猪的自身特点，对小型猪在生殖毒性实验中的应用情况进行综述，以期为此类研究提供一些参考价值。

1 小型猪动物模型在生殖毒性实验中应用的可行性

选择合适的动物模型对于药物生殖发育毒性研究有着重要的实际意义。一般选择何种实验动物取决于受试物的特点、动物对受试物的反应，以及受试物在动物体内的吸收、分布、代谢和排泄状况与人类的差异程度[5]。生殖毒性实验通常在两种动物，即啮齿类动物和非啮齿类动物中进行。常规选用的是大鼠和家兔，在一些特殊情况下也使用犬或非人灵长类动物。但当大鼠或家兔等传统动物不适合进行致畸性实验研究时，也可采用小型猪作为替代动物。例如，大鼠通过催乳素维持早期妊娠，不适合于评价多巴胺类兴奋剂或降低催乳素水平药物的生殖毒性实验。家兔对消化道功能紊乱和抗生素敏感，临床表现难以解释。非人灵长类存在动物保护和动物供应方面的问题，且大多数动物只生产一个子代而使应用受到限制。在生殖毒性试验中各种实验动物应用的优缺点，见表1。

现已发现小型猪对许多人类致畸物质具有敏感性[4]，如沙利度胺、羟基脲、乙醇、维甲酸、氨基蝶呤等。但几乎无检测方法，背景数据很少。并且小型猪的胎盘缺乏转移大分子物质（分子量超过5000）的能力，从而限制了小型猪在一些生物技术产品（例如抗体、疫苗）中的应用[11]。关于不同实验动物对受试物的适用性见表2。

2 小型猪动物模型在生殖毒性实验中的应用现状

根据科技文献报道，目前在药物毒理学试验中已有几十种不同品系的小型猪得到应用，但有关小型猪生殖毒性实验的研究资料还很有限。曾有文献报道哥延根小型猪的生殖特性[13]，以及相关的致畸性实验方案[14]和历史对照组数据资料，其外观畸形和内脏畸形的背景发生率为4%，最常见的畸形包括隐睾症（2.8%）、并指（趾）症（0.76%）、肌肉关节挛缩（0.32%）、腭裂（0.28%）、心室间隔缺损（0.24%）和横膈疝（0.24%）。

哥廷根小型猪对维甲酸的致畸作用非常敏感[15]，具有明显的剂量-反应（畸形发生率和严重性）关系，且畸形表现与人类的视黄酸胚病（小颌、腭裂、中枢神经系统畸形、小耳和心脏与胸腺的缺陷）极为相似。Hayama等[16]发现在哥廷根小型猪的器官形成期给予乙嘧啶可引起上腭裂和其他出生缺陷，也可导致功能性缺陷，如后肢瘫痪。Zomborszky-Kovács等[17]研究了烟曲霉素B（1）对猪胚胎的有害作用。另外，已有资料显示，小型猪对抗心律不齐药物经胎盘转移情况也与人类的经胎盘转移过程相似[18]。适用于晚期非小细胞肺癌的一线治疗及HER2阳性的晚期乳腺癌患者的新药阿法替尼[19]（口服）在2013年7月12日获美国食品及药物管理局（FDA）核准上市，在其临床前安全性评价中，由于犬严重的胃肠道反应，研究者选用了哥廷根小型猪进行安全性评价，提示在新药临床前研究中小型猪具有良好的应用前景。

3 小型豬生殖毒性实验研究

进行生殖毒性实验时，为发现给药所致的速发和迟发效应，实验观察应持续一个完整的生命周期[20]，即从某一代受孕到其下一代受孕间的时间周期。根据ICH药物生殖毒性研究技术指导原则，一般将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段[21]：A：从交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精）。B：从受孕到着床（成年雌性生殖功能、着床前发育、着床）。C：从着床到硬腭闭合（成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成）。D：从硬腭闭合到妊娠终止（成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长）。E：从出生到离乳（成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长）。F：从离乳到性成熟（离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）。

3.1 生育力与早期胚胎发育毒性实验

生育力与早期胚胎发育毒性实验（包括上述生命周期中的A～B阶段）用于评价受试物对动物生殖的毒性或干扰作用。评价内容包括配子成熟度、交配行为、生育力、胚胎着床前阶段和着床等[22]。实验通常选用啮齿类动物如大鼠，当大鼠不适合时则会选择另一种啮齿类动物或非啮齿类动物替代，选择主要基于受试物的特性，但是小鼠和非人灵长类常用作替代物种。小型猪由于发情周期短，大约3周，也是一个非常合适的选择，其精液资料与人类相似，但前列腺的发育程度低于精囊和尿道球腺（不同于人类），在雄性生殖器官病理学检查时可能会遇到间质细胞增生、生精小管发育不全等自发病变，从而影响研究结果的解释和判断。目前，国内尚未开展应用小型猪实验动物模型进行生育力和早期胚胎发育毒性的研究。

3.2 胚胎-胎仔发育毒性实验

在胚胎-胎仔发育毒性实验中（包括上述生命周期中的C～D阶段），小型猪的给药期从着床日（妊娠第11天）开始，至硬腭闭合日（妊娠第35天）结束[23]，包含整个妊娠期。根据不同的实验计划可采用最为合适的给药途径，包括皮内注射、静脉输注、外用给药等，但经口给药仍最为常见。在妊娠28～35 d，可通过超声检查确定小型猪的妊娠状态。研究期间需要对小型猪各种临床体征进行观察，并记录摄食量和体重的变化。在妊娠110～112 d处死小型猪进行剖宫检查。足月产小型猪胎仔体重为350～400 g，故此可对所有的胎猪进行尸检。胎猪的检查项目一般包括黄体数量、活胎数量、死胎数量、吸收胎数量、着床数量，对胎猪进行称重和外观畸形的检查，并确定胎猪的性别[24]。Bouin液固定后对半数胎猪进行内脏检查，通过茜素红染色法对半数胎猪进行骨骼检查。此外，也可采用X射线法或CT扫描对全部胎猪进行骨骼检查，检查的质量也超过茜素红染色法。

另外，为了进一步缩短小型猪致畸实验的期限，有研究者对哥廷根小型猪中期（妊娠第60天）和终末（妊娠第110天）剖宫产检查结果进行了比较分析，发现中期剖宫产胎猪大小与终末处死家兔时胎兔的大小和体重相当，生殖器官内部检查可确定胎猪性别，骨骼和软骨双染法可检出骨骼改变，并可检查出乙胺嘧啶诱发的胎仔异常[23]。从而表明小型猪中期剖宫产技术可行，并具有节省时间、开支等方面的优势。

3.3 围生期毒性实验

围生期毒性实验（包括上述生命周期中的C～F阶段）是对处于妊娠期或哺乳期的雌性动物从胚胎着床到幼仔离乳给药，目的是检测药物对母体以及胚胎和子代发育的不良影响，由于产生的不良作用可能延迟，实验应持续观察至子代性成熟[25-26]。评价内容包括妊娠雌性动物增强的毒性、产前产后子代的死亡情况、生长发育的异常以及子代的功能缺陷，包括F1代的行为、性成熟和生殖功能[27]。雌性动物给药期应从胚胎硬腭闭合至哺乳结束，即上述生命周期中的C～E阶段。通常，小型猪为妊娠第35天至离乳（出生后第174天）[15]。与其他非啮齿类动物相比，哥延根小型猪每窝仔猪数多，仔猪生长快，性成熟快，已建立许多成熟的行为测试方式[28]。在开展哥延根小型猪围生期毒性实验方面，已积累了一些经验。

4 小型猪动物模型在生殖毒性实验中的应用前景

小型猪发情周期和妊娠期短，胎仔数量多，胚胎大，便于观察微小畸形[29]，与人类在解剖学、生理学、疾病发生机制等方面存在一定的相似性，表明其可能作为生殖毒性实验的动物模型。其属于食源性动物，从动物福利的角度来看压力也要小很多。虽然人们已经认识到小型猪作为毒理学研究模型动物的优势[30]，但目前小型猪并未广泛应用于各类科学实验研究，在生殖毒性实验研究中也远不及家兔的位置。一方面是家兔已积累了丰富的背景信息，且容易获得、操作简单。另一方面，小型猪的应用还具有一定的局限性。首先是实验操作不便。虽然相对于普通猪，小型猪的体型已经小了很多，但还是和犬、猴一样属于大动物，在常规实验操作时，人员体能消耗大，并且缺乏实验室诊断的商业试剂盒[31]。其次，小型猪的胎盘缺乏转移大分子能力，从而限制了小型猪在一些生物技术产品（例如抗体、疫苗）中的应用。因此，目前在生殖毒性实验中小型猪还不能完全替代传统的非啮齿类动物。期待随着研究的不断深入，小型猪的背景数据会不断完善，在预测药物对人类产生的生殖毒性作用方面将具有越来越大的应用价值。

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