分子探针在细菌计数中的应用

焦洋，罗健，杨彦凤

(1.重庆子匀环保工程有限公司，重庆 400039；2.中国兵器工业第五九研究所，重庆 400039)



分子探针在细菌计数中的应用

焦洋1，罗健1，杨彦凤2

(1.重庆子匀环保工程有限公司，重庆 400039；2.中国兵器工业第五九研究所，重庆 400039)

分子探针是一种已知特异性的分子，在与生物靶分子结合以后，其带有的标记物可供反应后检测，从而反映出靶分子或其所在结构单元的各种信息。通过详细综述几种常见的分子探针，并且与其他类型的探针进行比较与区分，认为分子探针能够克服传统细菌计数法的缺点，可以对不同类型的细菌进行计数，具有快速、适用对象广泛的特点。但是，还需要开展进一步的工作，形成统一的判断标准和方法标准，并提高抗干扰性，以推动分子探针在细菌检测技术中的广泛应用。

水环境；分子探针；细菌计数；细菌

水环境中广泛分布着各种各样的细菌，它们构成了水体中微生物的主体。尤其是异养细菌在自然界物质和能量代谢圈中具有举足轻重的作用，能不断地促进水体中有机物质的分解或合成，并引起与之相关的一系列能量的转化，从而对水体水质产生重要的影响，是决定水质变化的关键之一。测定水体中细菌的数目是研究水体中细菌作用的基础。由于细菌种类的极端多样性，细菌计数技术一直受到广泛的关注和研究开发。目前常用的培养计数方法存在许多局限。由于分子生物学领域的突破，采用分子探针的细菌计数技术得到了迅速发展，正在成为水环境微生物学中十分重要的一个领域。

1 传统活菌计数方法的局限性

典型的传统细菌计数方法主要有平板计数法和最大或然计数法(MPN法)等等，这些方法均在固体或液体培养基中对待测菌种进行培养，然后根据培养后显现出的宏观结果(例如菌落密度(平板计数法)、液体培养基的显色情况(MPN法))来判断原始样品中的活菌浓度。这些方法普遍存在以下两个最主要的不足之处。

(1)培养时间长。细菌对培养基的适应以及细菌的生长繁殖都需要一定的时间，所以产生可观测到的结果需要较长的时间，通常在24 h以上甚至一周左右。

(2)培养条件对结果影响大。传统方法中，培养基的营养成分、培养温度、培养时间等对检测结果都有很大的影响，一种培养基往往仅能检测出一种或数种能够在该培养基中生存的细菌的数目，这只占实际细菌数量的极少部分，例如通常的平板计数只能检测到水中细菌数目的0.1%～10%[1]，从而大大影响了结果的准确性。表1给出了应用平板计数法对各类水样中的细菌进行计数时，所能检测到的细菌数占实际细菌数的比例[2]。

表1 平板培养计数法的局限性

传统活菌计数方法的上述缺点，在很大程度上限制了其在环境微生物学中的应用范围。另外，水样中的细菌种类繁多，不可能也没有必要在任何情况下都分门别类地对各种细菌都单独培养计数。而且，在实际情况下，一个有限范围内的各种细菌之间不可避免地发生着相互作用[3]，水体的宏观微生物学特性是它们共同作用的结果。而所有的传统技术在培养过程中都将细菌置于偏离它们原来的小环境的、新的人为的操纵条件下[4]，使其形成与原来并不完全相同的群落结构，甚至引起细菌偏离在自然状况下的生理习性，从而不能反映出它们的实际生长情况。因此，通过任何传统活菌计数技术都不能全面客观地认识水体微生物特性。

2 分子探针的概念

鉴于科学研究的需要以及传统活菌计数法的缺陷，研究人员开始致力于研究新的、准确有效的活菌计数方法[5]，分子探针技术作为一种主流方法，逐渐引起人们的关注。

从化学和生物学的意义上理解，分子探针是一种已知特异性的分子，在与靶分子结合以后，它带有的标记物可供反应后检测，从而反映出靶分子或其所在结构单元的各种信息。例如核酸分子探针，可通过嵌入作用、静电作用或者采用引物标记或衍生方法与核酸连接[6]；又如蛋白质和酶等生物大分子的荧光探针，能在溶液中与蛋白质分子静电吸引或氢键结合[6]。分子探针不仅仅适用于检测生物大分子，也适用于对非生物大分子进行分析，例如在色谱分析中，利用含有肼基(—NH-NH2)的分子探针可以与醛或酮等含有羟基的化合物发生缩合反应，生成相应的腙类化合物[6]，如下式所示。

靶分子与合适的探针结合后，可以通过分光光度分析、荧光检测[6]或者利用化学反应中产生的化学发光现象对靶分子被放大的结构、生理生化功能等目标特性进行检测。

因此，从结构上来讲，可以认为分子探针是这样一类有机试剂：它由母体、取代基和反应基团组成。反应基团与靶分子结合，取代基不参加反应。当适宜的分子探针通过反应基团与靶分子结合后，靶分子所包含的难以直接获得的待测信息就通过有机试剂的母体及取代基的固有特性或者整个有机试剂与靶分子结合以后的产物的新特性得以体现。

3 用分子探针对细菌计数的核心问题

分子探针的特异性和对微观体系的放大功能使之在微生物学上具有广泛的用途，最常见的是利用分子探针鉴定微生物的种属以及对微生物进行纯种分离[7-9]。这些方法普遍利用不同的核酸分子探针测定核酸分子中的核苷酸序列，从而精确地揭示微生物种类和遗传的多样性，可以跟踪特定的基因寄宿主微生物，并可以在同一时间研究多种微生物。

用分子探针进行活菌计数，实质在于利用分子探针鉴别细菌的“活性”，即侧重于从整体上把握细胞的生理特性，但是，用分子探针进行活菌计数应当明确下面两个要点：

●对水样中各种已知或未知种类的细菌，建立统一的“死”与“活”的界定标准

●合理选择分子探针

第一点是分子探针进行活菌计数的理论依据。一切活菌计数法都必然有其合理的依据，例如平板计数法，实际上认为在培养基上能够生长的细菌是具有“活性”的细菌。因而用分子探针对活菌计数，也必须有参照的标准。在对微生物进行计数时，基于不同标准的检测结果存在着重大差异[10]。所以针对分子探针法建立合理的界定标准，是具体技术开发和应用的基础。

第二点是分子探针进行活菌计数的技术核心，具体体现为三个方面：一是所选择的分子探针对“死”“活”两种状态下的细胞的渗透能力或与细胞中靶分子的结合能力要有显著差异。二是在同时使用两种或两种以上分子探针测定活菌数和总细菌数时，探针之间不能发生对检测结果产生影响的化学反应，而且探针的响应结果应有明显差异(例如两种荧光探针的荧光光谱波长应有较大间隔)。三是引入的分子探针不会在有限的时间内破坏细菌的活性而造成检测结果的严重失真。

4 几种常见的用于细菌计数的分子探针

下面介绍几种常见的分子探针，利用它们可以对细胞进行染色计数。

(1)碘化丙锭[6]

碘化丙锭(PI)是一种菲啶类核酸荧光分子探针，分子结构如下式所示。

其中，菲啶环是它的荧光团。它具有较大的水溶性和较小的膜渗透性，排斥活细菌，只能进入细胞膜遭到破坏的细菌。碘化丙锭与两种核酸(DNA和RNA)基本上属于无序结合，DNA的每4～5个碱基对同一个染料分子化学计量结合。碘化丙锭只能对死细胞进行染色，染色后能够发出波长为630 nm的红色荧光。

(2)吖啶橙(AO)

吖啶橙属于吖锭类荧光分子探针，分子结构如下式所示。

这个分子对细胞膜具有很强的渗透能力，既能够进入细胞膜遭到破坏的细菌内，也能够进入细胞膜完好的细胞内，然后通过嵌入或静电作用与DNA和RNA作用[6]。当与DNA结合时，该染料有绿色荧光，最大发射波长为525 nm；当与RNA结合时，最大发射波长移至650 nm左右，为红色荧光。

(3)DAPI

DAPI的化学名称为4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，分子结构如下式所示。

它是一种含有吲哚环的荧光分子探针，能够进入活细菌及死细菌的体内与dsDNA的小沟槽结合，选择性地键合到A-T碱基一簇，在激发光源的作用下发射蓝色荧光[6]。

(4)16S rRNA 寡聚核苷酸探针[11]

细胞的活性可通过核糖体的含量表现出来。利用16S rRNA 寡聚核苷酸标记探针原位杂交，可以反映出核糖体含量。由于这类探针只在核苷酸含量很高时才能具有可检出的结果(1000～10 000个/单细胞)，所以能与16S rRNA寡聚核苷酸探针杂交的细菌被认为是具有代谢活性的。用四甲基若丹明标记寡聚核苷酸分子探针，在绿色激发光下能放射出红色荧光。

以上列举的是细菌计数中常用的几种分子探针。在实际工作中，往往将两种或两种以上分子探针联合使用以同时测定细菌的总数和活菌数目。例如，Williams等人发明了一种联合应用DAPI和PI(碘化丙锭)同时对活菌和死细菌进行计数的方法[11]，就是利用DAPI能对活细菌与死细菌同时染色，而PI只能对死细菌染色，且染色后发射光谱明显不同的特点同时对细菌总数和死菌数目进行测定，二者之差即为活菌数目。另一种目前广泛使用的用于活菌计数的试剂叫作Live/Dead BacLight，它由两种核酸分子探针组成，一种是上面提到的碘化丙锭，另一种叫作SYSO9。后者既能渗透活细胞的细胞膜，也能渗透死细胞的细胞膜。当两种染色剂并存时，碘化丙锭穿透被破坏的细胞膜后与SYTO9试剂竞争性地同核酸结合。由于碘化丙锭与核酸的结合能力较强，就将SYTO9试剂从核酸中置挀出朴。这样，有完整细胞膜的活细菌呈现绿色荧光，细胞膜被破坏的死细菌呈现出红色荧光。利用落射荧光显微镜配合适当的滤光设备，活细菌和死细菌就能分别或同时被观察到。

它能够渗透细菌的细胞膜进入细胞中。活细菌的酯酶具有活性，能够切断FDA分子的二乙酸基团，从而使FDA显出荧光性[15]。

5 用分子探针对细菌计数的优缺点

较之传统细菌计数法，分子探针具有不可比拟的优越性，主要体现在以下几点。

快速。例如用吖啶橙对细菌染色时，大约只需要30 min的培养时间；用Live/Dead BacLight对细菌染色，培养时间也在15～20 min。这些方法均大大缩短了细菌计数的时间，使得在线监测成为可能，同时也在一定程度上避免了将细菌从原来的生存环境中长期分离而引起偏差。

适用对象广泛。鉴于分子探针的靶物通常是细胞内普遍存在的生物大分子，不因细菌的种类不同而存在或缺乏。所以在一般情况下，其计数结果与细菌的种类无关。这种普适性也使得计数的结果更接近于水样中细菌的实际情况。

可同光电技术等结合，使操作更为方便灵活。例如，利用分光光度计或者流式细胞仪能够即刻获得结果。

但是，在现阶段，利用分子探针对细菌进行计数，也存在着许多尚待解决的问题。首先是方法的结果比较不稳定，各种分子探针得到的结果之间可比性相对较差，这是因为这些方法基于各自不同的鉴定标准。其次是干扰因子对结果的影响较大。例如对于多细胞真核生物，也可能被检测出来，造成检测的不准确性；又如水体中有很多类似于细菌的可染色微粒，用DAPI和AO染色的结果不能将这些微粒从细菌中区分出去，造成结果失真[5]；细胞膜的通透性的变化对测定的结果也会产生影响[4]。

6 发展方向

鉴于前面讨论过的分子探针对细菌计数的核心问题，结合现阶段存在的问题，可以考虑从两个方面对分子探针技术进行改进和完善。

首先是建立更加科学合理、更为全面的界定标准。这里涉及概念的标准化和方法的标准化。概念的标准化，即以定义的形式明确被检测对象的基本特征。当概念明确后，就能限定操作结果的范围，从而避免其他干扰因素引起的混乱。例如，利用分子探针对活菌计数时，有关于“活性”的概念，目前就主要是从下面三个层次阐述的[16]：一是生长繁殖能力(viability)。这个概念对于检验细菌的“活性”而言最为严格，它不仅涉及代谢活力，也涉及细胞膜的完整性。但是，在DNA遭到了不可逆的破坏、生长环境缺乏营养或者生长极其缓慢等情况下，就难以对生长繁殖能力进行衡量；二是代谢活力(activity)。这个概念相对于第一个概念来说要“宽松”一些，它反映了细菌进行生命活动的可能性。但是如果由于细胞损伤、饥饿等引起能量或代谢途径的缺失时，用这个概念去衡量细菌的“活性”存在着一定的问题；三是细胞膜的完整性(integrity of membrane)。如果细胞膜不完整，细菌就不能维持膜电位，代谢将终止，从而可认为该细菌已经“死亡”。而且其内部结构将暴露在外界环境中，最终将会分解。这三个层次的概念在不同程度上对细菌的“活性”进行了界定，显然由第一个概念所得到的计数结果相对比较严格，但是基于此概念的检测手段必然更为复杂。第三个概念最具有直观性，相应也最为简单，因此目前多数分子探针都是基于第三个概念对细菌进行计数的。

方法标准化，即在建立概念明确的基础上，建立相应的标准方法。标准方法一旦确定，就使得检测结果之间具有可比性，技术更加规范化。

其次是开发更准确、更具有针对性的技术。更准确，是指所采用的分子探针技术能够更好地排除前述的干扰因素，对细菌能够具有更强的专一性。这一点对于方法的标准化也是十分重要的。更具有针对性，是指能够开发出具有明确使用目的的分子探针。例如在研究水体受污染程度时，往往需要了解水体中厌氧微生物和好氧微生物的情况，而目前尚未有专门针对这两类微生物的分子探针。一般认为，好氧细菌普遍含有超氧化物歧化酶(SOD)，而专性厌氧细菌中这种酶的含量很少(或完全没有)，因此，如果能够开发出专门针对SOD的分子探针，无疑对于研究好氧微生物与厌氧微生物的关系具有十分重要的意义。由此可见，专一性的分子探针的出现，必将对环境微生物的研究起到重要的推动作用。

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Application of Molecular Probes in Bacteria Counting

JIAO Yang1, LUO Jian1, YANG Yan-feng2

(1.Chongqing Ziyun Environment Engineering Co., Ltd., Chongqing 400039, China; 2.No.59 Institute, China Ordnance Industry, Chongqing 400039, China)

Molecular probes are a kind of molecules that can specifically be combined with bio-targeted molecules. The markers of the probes can be detected after the reaction, thus reflecting the information of the targeted molecules or the structures including the molecules. In this paper, several molecular probes are further described in detail and compared with other kinds of probes. It is concluded that molecular probes can overcome the deficiencies of traditional bacterial counting methods, and different types of bacteria can be counted in a rapid manner. Molecular probes can be applicable to a wide range of objects. On the other hand, further work needs to be done to unify the identification standard of judgment and method, so as to improve the anti-interference of the method, thus promoting the application of molecular probes in bacteria detection.

water environment; molecular probe; bacteria counting; bacteria

2017-06-12

焦洋(1978—)，男，贵州贵阳人，工程师，硕士，主要研究方向为工业废水处理，E-mail：122089103@qq.com

罗健(1971—)，男，四川泸县人，工程师，主要研究方向为环境工程微生物， E-mail：673359479@qq.com

10.14068/j.ceia.2017.04.020

X835

A

2095-6444(2017)04-0088-05