bcl-2在早期外伤性癫痫大鼠中的表达

王 文，寇小波，江 涛，乔 伟，杜 陈，黄其军，冯爱平*

（德阳市第二人民医院神经科，四川 德阳 618000）

bcl-2在早期外伤性癫痫大鼠中的表达

王 文，寇小波，江 涛，乔 伟，杜 陈，黄其军，冯爱平*

（德阳市第二人民医院神经科，四川 德阳 618000）

目的 研究早期外伤性癫痫大鼠皮层脑组织中bcl-2的表达。方法 将30只成年SD大鼠随机分为正常对照组、实验组、生理盐水组（假手术组）。正常对照组大鼠不做任何处理，实验组大鼠皮层注射FeCl3，生理盐水组大鼠注射生理盐水。24小时后检测bcl-2的mRNA表达水平、bcl-2蛋白的表达水平。结果 行为学观察发现，正常对照组和生理盐水组大鼠均未见痫性发作，实验组大鼠可观察到痫性发作；实验组和生理盐水组bcl-2的mRNA和蛋白表达均较正常对照组增高（P＜0.05），但实验组较生理盐水组显著下降（P＜0.05）。结论 bcl-2在PTE大鼠皮层脑组织中表达显著下降，细胞凋亡可能与PTE的形成有关。

bcl-2；细胞凋亡；外伤性癫痫

外伤性癫痫(post-traumatic epilepsy，PTE)是一种严重的疾病，通常继发于颅脑损伤，属于临床常见病，占症状性癫痫病的10%～20%[1]。癫痫发作可进一步加重脑损伤。创伤性脑损伤后存在细胞凋亡基因的表达，特别是B细胞淋巴瘤-2（bcl-2）基因的表达。PTE是由颅脑外伤发展而来，既然脑外伤后存在细胞凋亡相关基因bcl-2的表达，是否PTE也存在这些基因的表达及表达的程度如何，目前研究较少。本实验通过研究铁离子致痫大鼠模型脑组织中bcl-2的表达情况，探讨早期外伤性癫痫的的可能发病机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取清洁级健康雄性SD大鼠30只，体重为200～250 g。随机分为正常对照组、实验组和生理盐水组（假手术组）三组，每组均为10只。采用购于美国Sigma公司的FeCl3溶液（100 mmol/L），bcl-2兔单克隆抗体IgG购于美国Abcam公司，β-肌动蛋白（actin）鼠多克隆抗体IgG及辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购于中国北京中杉金桥公司，由中国北京六合华大基因科技公司合成PCR引物，Trizol RNA抽提试剂、SYBR Green PCR Master Mix及逆转录试剂盒购于日本TaKaRa公司。

1.2 铁离子致痫大鼠模型的制作

参照Golden N等[2]及笔者既往[3]实验方法，采用浓度为3.5%、剂量为10 mL/kg的水合氯醛麻醉大鼠，于立体定位仪上固定，备皮、消毒并切开头皮。在左侧冠状缝后1 mm、矢状缝旁2 mm处钻开颅骨，暴露皮层脑组织。进针深度3 mm，注射浓度为100 mmoL/L 的FeCl3溶液5 μL，匀速注射（在5 min内），并留滞针头数分钟以防溶液外溢。注意切勿钻穿硬脑膜伤及皮层脑组织，以免引起颅脑创伤出血干扰实验结果。正常对照组不做处理，生理盐水组（假手术组）在同样位置注射5 μL 0.9%NaCl。麻醉苏醒后观察行为学表现，癫痫发作评分参照改良Racine法(0分为无癫痫发作；1分为愣神发作；2分为口面部痉挛、点头；3分为一侧前肢阵发性抽搐；4分为两侧前肢痉挛及持续性点头；5分为前肢阵挛、强直或跌倒；6分为发作衰竭致死)。本组将≥3分的行为学改变定义为癫痫发作，符合条件者认定为成功。对于造模失败者，补齐动物，重新造模。伤后24 h，通过腹腔注射水合氯醛的方式，对大鼠进行麻醉，断头取脑；然后，对左侧大脑皮层注射区域标本进行分离、冲洗并保存。

1.3 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测bcl-2 mRNA表达

取约80 mg脑组织标本，参照说明书提取总RNA（Trizol法），微量分光光度计（美国BIO-RAD公司）检测RNA样品浓度（A值）及纯度（A260/A280值在1.7～2.0范围内）并进行标化。逆转录合成cDNA为模板，β-actin为内参照进行实时定量PCR反应（美国BIO-RAD公司的IQ5 RTPCR仪）。25 μl反应体系中包含12.5μl SYBR GREEN，10 ul PCR水，0.25 μl上游引物，0.25μl下游引物和2μl cDNA。引物序列见表1。反应条件如下：50℃ 2 min，95℃ 5 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，40个循环。PCR结果采用Ct值比较相对定量法，β-actin为内参照。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 Western blotting检测bcl-2蛋白表达

按照说明书对总蛋白质进行提取，以BCA法对其浓度情况进行检测。以β-actin为内参蛋白，将提取的蛋白样品加入变性缓冲液放入沸水中，继续蒸煮5分钟；紧接着，再进行5分钟的10000 r/min离心，并在此基础上上样。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转至硝酸纤维膜。在4℃封闭环境中，将经过5%脱脂牛奶处理过的硝酸纤维膜放置并过夜；在此基础上，再加入抗体孵育过夜，即抗β-actin抗体、抗bcl-2抗体。加入二抗于37℃孵育1 h。化学发光法进行显色，通过Image J来检测蛋白定量情况。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0分析，多组间均数的比较采用单因素方差分析，数据以（±s）表示。检测水准α=0.05。

2 结 果

2.1 行为学观察

实验组共给12只大鼠左侧运动-感觉皮层注射铁离子，10只出现与人类发作相似的发作行为，主要有自动症（面部肌肉颤动、规律性点头、湿狗样抖动）、上肢抖动并发展为向对侧翻滚以及严重而持续的边缘运动性惊厥（全身性强直-阵挛发作），未见发作严重而死亡的大鼠。伤后6 h内发作最为频繁，局灶性发作多见。发作间期进食、活动减少。见表2。正常对照组和生理盐水组大鼠未观察到癫痫发作。

表2 大鼠癫痫发作行为学表现

2.2 RT-PCR结果

实验组bcl-2 mRNA的表达较正常对照组增高（P＜0.05），较生理盐水组下降（P＜0.05）。见表3。

表3 大鼠皮层bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平

1）经LSD-t检验，与正常对照组比较，P＜0.05；2）经LSD-t检验，与实验组比较，P＜0.05。

2.3 Western blotting结果

实验组bcl-2的蛋白表达较正常对照组增高（P＜0.05），较生理盐水组显著下降（P＜0.05）。见表3、图1。

图1 Western blotting显示bcl-2蛋白的表达，1：正常对照组；2：实验组；3：生理盐水组。

3 讨 论

癫痫发作是颅脑损伤后的严重并发症，脑损伤愈重，并发癫痫的机会愈大，特别是开放性脑损伤。治疗困难，易发展成为难治性癫痫。由于人类PTE脑组织标本获取困难，故以动物模型为研究对象。目前铁离子致痫模型最为常用，本组采用皮层注射FeCl3作为致伤机制，成功率高，与文献报道及笔者既往研究类似[2-3]。

颅脑外伤是人类死亡和残疾的主要原因之一，其后的一系列病理生理反应称为继发性损伤，继续破坏损伤周围脑组织，导致大量的神经元丢失。其中，细胞凋亡机制起到主要作用[4]。bcl家族与细胞凋亡信号通路相关，主要包括抑制细胞凋亡的基因bcl-2和促进细胞凋亡的基因如bax，bcl-2蛋白的活化受bax调节，bax的表达可以增加线粒体膜的通透性，导致细胞色素C释放到细胞质，激活caspase-3，这不可避免地导致神经元的凋亡[5]。而bcl-2作为一种“保护性”基因已经在有关实验中得到证实。在TBI早期能观察到bcl-2的表达[6]，而且伴随着bcl-2表达的下降，常伴有细胞凋亡性死亡增多的现象。应用bcl-2多肽能够减轻TBI后海马区神经元的丢失，进一步支持bcl-2的“保护性”作用。本组研究通过RT-PCR检测发现，PTE大鼠伤后24小时皮层脑组织bcl-2的mRNA表达较生理盐水组（假手术组）下降，Western blotting检测显示bcl-2蛋白在伤后也明显下降。另外，实验组皮层脑组织bcl-2的mRNA及蛋白表达均较正常对照组增高，也充分说明颅脑损伤后神经细胞凋亡的发生。PTE大鼠抑制细胞凋亡的bcl-2的低表达，充分说明颅脑损伤后细胞凋亡与PTE有关。这与人类脑组织标本的研究结果类似[7]。

综上所述，本实验结果提示皮层脑组织中bcl-2的低表达与大鼠早期PTE发作密切相关。铁离子致伤后抑制细胞凋亡的bcl-2呈现低表达，导致细胞凋亡发生，引起神经元异常放电，最终诱发PTE。需要指出的是，本研究的不足在于目前只是一种现象研究。但为在动物模型中继续研究细胞凋亡与外伤性癫痫相关性提供了依据。

[1] Pitkänen A, Immonen R. Epilepsy related to traumatic brain injury[J]. Neurotherapeutics, 2014,11(2):286-96.

[2] Golden N, Darmadipura S, Bagiada NA. The difference in seizure incidences between young and adult rats related to lipid peroxidation after intracortical injection of ferric chloride[J]. Singapore Med J, 2010,51(2):105-9.

[3] 王文.STIM1、ORAI1在外伤性癫痫大鼠中的表达.(03),2013.

[4] Lončarević-Vasiljković N, Milanović D, Pešić V, et al. Dietary restriction suppresses apoptotic cell death, promotes Bcl-2 and Bcl-xl mRNA expression and increases the Bcl-2/Bax protein ratio in the rat cortex after cortical injury[J]. Neurochem Int,2016,96:69-76.

[5] 张淑玲,常全忠,李银生,郭学鹏.缺氧缺血性脑损伤大鼠脑内bcl-2基因表达与细胞凋亡的关系.实用儿科临床杂志,2004(05):387-388+434.

[6] Raghupathi R, Conti AC, Graham DI, et al. Mild traumatic brain injury induces apoptotic cell death in the cortex that is preceded by decreases in cellular Bcl-2 immunoreactivity. Neuroscience. 2002. 110(4): 605-16.

[7] 蔡卫林,唐运林,何鹏翔,等.Bcl-2蛋白在外伤性癫痫病灶中的表达[J].中国法医学杂志,2010(05):312-314+318.

本文编辑：李新刚

The expression of bcl-2 in post-traumatic epilepsy rats

WANG Wen, KOU Xiao-bo, JING Tao, QIAO Wei, DU Chen, HUANG Qi-jun, FENG Ai-ping
(Department of Neurology, Deyang Second People's Hospital, Sichuan Deyang 618000, China)

Objective To investigate the expression of bcl-2 in cortical brain tissue of post-traumatic epilepsy rats. Methods 30 adult SD rats were randomly divided into control group、experimental group and NS group. The rats in the normal control group did not do any treatment。The experimental group were injection FeCl3,the NS group were injection with saline.The mRNA expression level of bcl-2 and the expression level of bcl-2 protein were detected after 24 h. Results Typical seizures were observed in experimental group. In the mRNA and protein expression of bcl-2, the other two groups declined compared to the control group. However, the experimental group was lower than those in the NS group (P＜0.05). Conclusions The expression of Bcl-2 in the cortical brain tissue of PTE rats decreased significantly, and apoptosis might be related to the formation of PTE.

bcl-2; Neuronal apoptosis; post-traumatic epilepsy

R-332

A

ISSN.2095-8242.2017.22.4162.02

德阳市科学技术和知识产权局基金（2014SZ037）资助

冯爱平